郭文婷, 劉曉曦, 王 鵬

(同濟大學 海洋地質國家重點實驗室, 上海 200092)

勞盆地熱液噴口沉積物微生物多樣性初步研究

郭文婷, 劉曉曦, 王 鵬

(同濟大學 海洋地質國家重點實驗室, 上海 200092)

采用聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術對勞盆地熱液區(qū)TVG9站位沉積物中細菌、古菌多樣性進行了調查, 并構建其細菌、古菌種群的16S rRNA基因文庫。研究結果表明, 該站位細菌包含變形桿菌(Proteobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospira), 疣微菌(Verrucomicrobia)等3個類群, 其中變形桿菌占據(jù)優(yōu)勢地位, 由Alphaproteobactria, Gamaproteobactria, Deltaproteobactria等 3個亞群組成。古菌包含泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota), 其中泉古菌占優(yōu)勢,由MGⅠ(Marine GroupⅠ)和MCG(Miscellaneous Crenarchaeotal Group)兩類群組成, 而廣古菌主要由MBGE(Marine Benthic Group E)組成。旨在揭示深海熱液區(qū)的微生物多樣性, 為生態(tài)環(huán)境的研究提供理論支持。

勞盆地; 熱液噴口; 沉積物; 微生物多樣性; 聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)

1977年人類首次在加拉帕戈斯海嶺發(fā)現(xiàn)熱液噴口, 之后在東北太平洋 Juan de Fuca、大西洋中脊Rainbow熱液區(qū)、Lost City熱液區(qū)、印度洋中脊、北冰洋洋中脊等處都有類似發(fā)現(xiàn)。深海熱液噴口具有高溫、高壓等特征, 不斷釋放出含有高濃度有毒元素(硫和重金屬)的缺氧熱液羽流, 在與周圍冷海水逐漸混合過程中, 呈現(xiàn)出急劇變化的溫度、化學梯度,為生理、代謝機制及系統(tǒng)發(fā)育有所不同的微生物提供了巨大的潛在棲息地[1]。熱液噴口是深海極端環(huán)境中的極端, 尤其是其中不依賴于太陽能的黑暗食物鏈的發(fā)現(xiàn), 激發(fā)起人們對深海生物多樣性及生命起源和進化的極大興趣[2-3]。由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)手段的局限性及深海生境的特殊性,自沉積物和洋殼中分離得到的微生物數(shù)量非常有限[4-5]。20世紀 80年代末至90年代, 分子生物學技術開始被廣泛應用于微生物群落結構的分析[6-7]。近年來, 不依賴培養(yǎng)的16S rRNA基因鑒定技術揭示出大量先前未被發(fā)現(xiàn)的獨特的微生物群落[8-9], 使對未培養(yǎng)微生物進行分析成為可能。多種分子生物學技術聯(lián)合應用, 還可以彌補單一技術的不足, 因而成為微生物生態(tài)學研究中的常見手段[10]。

勞盆地位于西南太平洋湯加島以西, 是殘留島弧(勞海嶺)與活動火山弧(Tofua火山弧)之間的一個弧后盆地, 是第一個被認為由于火山島弧擴張形成的年輕海盆[11]。1989年Nautile號潛水艇在此發(fā)現(xiàn)了眾多活躍的熱液噴口, 它們與在洋中脊的熱液在生物群落、化學成分、溫度、礦石成分等方面都有明顯的差異[12]。以往的研究多集中在洋中脊熱液區(qū), 對弧后盆地熱液區(qū)的微生物生態(tài)系研究還很少[13-14]。本文采用聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術, 對勞盆地深海熱液噴口一個沉積物站位中的細菌和古菌分布進行了初步研究, 旨在了解該區(qū)域微生物生態(tài)系的組成及多樣性, 為揭示微生物在海洋沉積物和洋殼中的生物地球化學作用[15-16]奠定基礎, 進而促進深海熱液生物資源的研究和利用。

1 材料與方法

1.1 材料

本文研究的樣品來自“大洋一號”科考船2007年5月在勞盆地東勞擴張中心熱液區(qū)的DY-19-4 TVG9站(176.6018°W, 22.1813°S), 由電視抓斗采樣器采集。樣品為鐵紅色沉積物。采用無菌方式進行二次取樣后立即保存于-20℃, 運回實驗室保存于-80℃。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取、純化

DNA提取采用Wang[17]等的方法。粗提DNA產(chǎn)物用QIAquik PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化, 用于后續(xù)實驗。

1.2.2 16S rRNA 基因PCR擴增和純化

采用細菌 16S rRNA 基因通用引物(27F：5′—AGAGTT TGA TCM TGG CTC AG—3′; 1492R：5′—GGT TAC CTT GTT ACG ACT T—3′; M為A或C)[18]和古菌16S rRNA基因通用引物(21F：5′—TTC CGG TTG ATC CYG CCG CCG GA —3′; 958R：5′—YCC GGC GTT GAM TCC AAT T —3′; Y 為 C 或 T, M 同上)[19]進行 PCR擴增。擴增反應在 PTC-221熱循環(huán)儀(BIO-RAD)上進行。細菌 PCR 擴增條件： 95℃3 min; 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 33 個循環(huán); 72℃ 10 min。古菌PCR擴增條件： 95℃ 3 min;94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 每個循環(huán)降低0.2℃, 72℃1.5 min, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。UNIQ-10柱式膠回收試劑盒(上海生工)純化PCR產(chǎn)物。

1.2.3 克隆文庫構建和RFLP 分析

將回收的 PCR 產(chǎn)物克隆到 PMD-18T載體(TaKaRa)上, 轉化到E. coli DH5α感受態(tài)細胞中,涂布接種于含有X-gal和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16 h左右, 藍白斑篩選法挑取陽性克隆子,進行菌落 PCR擴增。所得產(chǎn)物用限制性內切酶MspⅠ/HpaⅡ(Fermentas)37℃過夜酶切, 經(jīng) 3%凝膠電泳得到RFLP酶切圖譜。

1.2.4 測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

挑選不同帶型的克隆子測序(上海英俊生物技術有限公司), 將所得序列提交到 RDP Ⅱ(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫, 利用在線工具 CHIMERA CHECK進行序列有效性驗證; 通過 BLASTN程序(www.Ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索相似性序列,采用 Clustal X(version 1.8)對比分析序列, 利用MEGA(version 4)軟件中的 Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 DNA提取和PCR擴增

從5 g沉積物樣品中抽提的環(huán)境基因組DNA片段大小集中在23 kb左右, 純化后的擴增產(chǎn)物條帶單一, 細菌和古菌的片段大小分別為1 500 bp和900 bp,表明擴增效果較好。

2.2 克隆文庫的構建和RFLP分析

自克隆文庫中隨機挑選 88個細菌克隆子和96個古菌克隆子, 限制性內切酶酶切后進行 RFLP分析。根據(jù)酶切圖譜和系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果, 細菌克隆文庫可歸屬于50個OUTs(Operational Taxonomic Units), 3個優(yōu)勢 OUTs分別占總細菌文庫的 18.0%,14.0%, 12.0%, 其余相對豐度較低, 僅含有1～3個克隆子。古菌可歸屬于16個OUTs, 其中4個優(yōu)勢OUTs分別為66.7%, 7.3%, 5.2%和4.2%, 其余12個OUTs的相對豐度較低, 僅含有1～2個克隆子。

2.3 細菌16S rRNA基因文庫多樣性分析

細菌文庫可劃分出 3個類群(圖 1), 變形桿菌(Proteobacteria)占絕對優(yōu)勢(88.6%), 該門又可分為Alphaproteobactria, Gamaproteobactria, Deltaproteobactria三個亞群, 分別占細菌文庫總量的 57.3%,27.4%和3.9%。其他類群含量相對較少： 8.0%歸屬于硝化螺旋菌(Nitrospira), 3.4%歸屬于疣微菌(Verrucomicrobia)。變形桿菌類群在海洋沉積物中分布廣泛, 往往是熱液流和海水相互作用環(huán)境中優(yōu)勢種群[20],但其比例和優(yōu)勢亞群有所差異。如在Rainbow熱液區(qū)沉積物中Gamaproteobactria是最為優(yōu)勢的類群, 大約一半屬于該變形菌門[21]。在勞盆地沉積物檢測中發(fā)現(xiàn), 基因型TVG9B-122(9個克隆子)和 TVG9B-97(7個克隆子)與地殼熱流中的序列有很高的相似性(97%～98%), 其余基因型與來自西太平洋暖池等其他海洋環(huán)境沉積物中序列有 91%～99%相似性。

2.4 古菌16S rRNA基因文庫多樣性分析

泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota)分別占古菌總量的 70.8%和 29.2%, 序列與深海環(huán)境相關序列有較高的同源性。泉古菌包含MGⅠ(Marine Group Ⅰ)和 MCG (Miscellaneous Crenarchaeotal Group) 2個類群(圖2)。其中以MGⅠ為主, 占古菌文庫的 59.4%, MCG占古菌文庫的11.4%。結果表明, 在TVG9站位的古菌類群中MGⅠ為優(yōu)勢菌群, 它的同源序列分別來自南沖繩海槽熱液流和馬里亞納海槽南部地熱流, 相似性依次為98%, 99%。MGⅠ在海洋中分布廣泛, 在海水和沉積物中都被檢測到過。如在對Juan de fuca熱液口沉積物的研究發(fā)現(xiàn)[22], 所得到的克隆子全部屬于 MGⅠ,認為熱液環(huán)境中的氨氧化古菌可能來自于這個類群,參與氮的循環(huán)。MCG最初在海洋中被發(fā)現(xiàn), 后來在陸地和海洋沉積物中都被檢測到[4,23]。該類群同源序列分別來自馬里亞納海槽地熱流、武爾卡諾島地熱井和瓜伊瑪斯海盆地熱噴口沉積物。

圖1 基于16S rRNA基因的TVG9沉積物細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Bacterial phylogenetic tree based on partial 16S rRNA clones from the sediment sample of TVG9

廣古菌以 MBGE(Marine Benthic Group E)(19.6%)為主, 是一種與甲烷代謝有關的古菌類群[24],與勞盆地東擴張區(qū)及馬里亞納海槽南部熱液區(qū)得到的克隆子相似性均為 99%。其他類群占 9.6%, 本研究中得到克隆子在勞盆地和其他熱液環(huán)境下得到的基因型相似性較高(98%～99%)。

3 結論

本研究結果表明, 所構建細菌和古菌文庫中的克隆子大多與熱液活動相關, 說明該區(qū)域受熱液活動的影響顯著。探究造成勞盆地和其他熱液研究中微生物種群組成差異性的原因, 認為可能是由于勞盆地熱液區(qū)獨特的洋殼化學組成[25-27]與熱液噴口活動的協(xié)同作用下, 逐漸形成了與其相適應的微生物生態(tài)結構。

圖2 基于16S rRNA基因的TVG9沉積物古菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Archaeal phylogenetic tree based on partial 16S rRNA clones from the sediment sample of TVG9

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Phylogenetic analysis of microbial diversity of the sediment from Lau basin

GUO Wen-ting, LIU Xiao-xi, WANG Peng
(State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, Shanghai 200092, China)

May,24,2011

Lau Basin; hydrothermal vent; sediment; microbial diversity; polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)

The bacterial and archaeal diversity of the deep-sea sediment collected at Lau Basin TVG9 sites were analyzed using a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis of 16S rRNA gene sequences. The 16S rRNA gene libraries were constructed. The results showed that there were three phyla in the Bacteria domain, including Proteobacteria, Nitrospira, Verrucomicrobia, and the phylum Proteobacteria is predominant, which has three sub-groups including Alphaproteobactria, Gamaproteobactria and Deltaproteobactria. In the Archaea domain, Crenarchaeota dominates over Euryarchaeota. There were two divisions in the Crenarchaeota kingdom, MGⅠ(Marine Group Ⅰ)and MCG(Miscellaneous Crenarchaeotal Group). The MBGE(Marine Benthic Group E) is the dominant group in the Euryarchaeota. This study has uncovered the microbial diversity in the deep-sea hydrothermal region, and provided more evidence for the ecology environmental research.

Q938

A

1000-3096(2012)07-0023-05

2011-05-24;

2012-04-24

國家自然科學基金(91028005)

郭文婷(1977-), 女, 遼寧盤錦人, 講師, 在讀博士研究生,主要從事海洋地質微生物學研究, E-mail： wenting.g@163.com; 王鵬,通信作者, 電話： 021-65982012, E-mail： pengwang@#edu.cn

(本文編輯：劉珊珊)