智成芳，姜言麗，曲韻智，景 舒

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，呼和浩特 010110;2.北京正大綠洲制藥有限公司，北京 101113)

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Alltech 426型泵(Alltech，美國);UVIS 200型檢測器(Alltech，美國);Allchrom Plus色譜工作站(Alltech，美國);液體渦流混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);微量定量移液器(Brand，德國);奧立龍868型酸度計(jì)(Thermo Orion，美國);BP211D型電子分析天平(Sartorius，德國);SHB－Ⅲ型循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸曲馬多緩釋滴丸(北京正大綠洲制藥有限公司);鹽酸曲馬多片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司);鹽酸曲馬多對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號200503);氧氟沙星對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號200403);磷酸(分析純，北京化工廠);三乙胺(北京化工廠);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher，美國);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher，美國);乙酸乙酯(分析純，北京化工廠);正己烷(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔(約1～1.5 kg)，雄性，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，動(dòng)物合格證號:SCXK京2005－0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 鹽酸曲馬多(Tr)對照液的制備 精密稱取Tr對照品25.15 mg于25 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2.5 ml于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸曲馬多對照液(0.053 mg/ml)。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取氧氟沙星對照品24.72 mg于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 ml于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標(biāo)溶液(0.098 9 mg/ml)。

2.2 色譜條件 色譜柱:Agela C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);保護(hù)柱:Dikma C18柱;流動(dòng)相:乙腈－0.5%三乙胺水溶液(加磷酸調(diào) pH值至3.5)(22∶78);檢測波長:220 nm;流速:1 ml/min。

2.3 血漿樣品處理方法 取血漿1 ml，置10 ml具塞離心管中，加入內(nèi)標(biāo)物溶液20 μl，渦漩混合0.5 min，加 0.1 mol/L NaOH 溶液 0.5 m l，渦漩混合 1 min，加入乙酸乙酯1 ml和正己烷4 ml，渦旋混合3 min，4 500 r/min離心 10 min，于 － 18 ℃ 冰箱中冷凍 2 h［1，2］。移取有機(jī)層置5 ml離心管中，40℃水浴揮干，加100 μl流動(dòng)相，渦漩混合1 min，取20 μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

圖1 空白血漿(A)Tr(B)Tr+內(nèi)標(biāo)(C)空白血漿+Tr+內(nèi)標(biāo)(D)血漿樣品(E)HPLC圖譜

2.4 分離度和專屬性 按上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。Tr、內(nèi)標(biāo)及血漿中的內(nèi)源物分離良好，由圖1可知，內(nèi)標(biāo)與Tr的保留時(shí)間分別為4.983 min和8.833 min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.5.1 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取Tr對照液 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 和 8.0 ml于 10 ml量瓶中，各加入內(nèi)標(biāo)溶液2 ml，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖。以Tr濃度為橫坐標(biāo)，以Tr峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A s/A i)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程1:

Y=0.027 5 X －0.007 3(r=0.999 8，n=7)

Tr在0.053 ～40.24 μg/ml范圍內(nèi)，濃度與 A s/A i有良好的線性關(guān)系。

2.5.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿1 ml于10 ml具塞試管中，加入計(jì)算量的Tr對照液，使血漿中藥物濃度分別為 20、80、200、400、1 000、2 000 和 4 000 ng/ml，按“血漿樣品處理方法”自“加入內(nèi)標(biāo)物溶液20 μl”起同法操作，以Tr濃度為橫坐標(biāo)，以Tr峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A s/A i)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程2:

Y=0.000 5 X －0.008 6(r=0.998 3，n=7)

結(jié)果表明，Tr血藥濃度在20～4 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，符合體內(nèi)測定要求。方法最低檢測濃度為20 ng/ml。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 提取回收率 取空白血漿1 ml于10 ml具塞試管中，加入Tr對照液適量，使血漿中藥物濃度分別為80、400和2 000 ng/ml，按“血漿樣品處理方法”加0.1 mol/L NaOH 溶液 0.5 ml，渦漩混合 1 min，加入乙酸乙酯1 ml和正己烷4 ml，渦旋混合3 min，4 500 r/min離心10 min，于－18℃冰箱中冷凍2 h。移取有機(jī)層置5 ml離心管中，40℃水浴揮干，加100 μl流動(dòng)相，渦漩混合1 min，取20 μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。將(A s/A i)代入溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿中Tr的回收率，結(jié)果見表1。

2.6.2 方法回收率 取空白血漿1 ml于10 ml具塞試管中，加入Tr對照液適量，使血漿中藥物濃度分別為80、400和2 000 ng/ml，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖。將(A s/A i)代入血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿中Tr的回收率，結(jié)果見表1。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取空白血漿1 ml于10 ml具塞試管中，加入Tr對照液適量，使血漿中藥物濃度分別為80、400和2 000 ng/ml，每個(gè)濃度分別配制5份，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作，分別在日內(nèi)和日間取20 μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。將(A s/A i)代入血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 回收率和精密度表

2.7 Tr緩釋滴丸兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.7.1 服藥方案及樣品采集 單劑量交叉口服給藥［3－6］:將10只兔子隨機(jī)分成兩組，每組5只。第1組口服鹽酸曲馬多緩釋滴丸片(50 mg)，第二組口服鹽酸曲馬多(50 mg)，于給藥后不同時(shí)間(緩釋滴丸0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 和 24.0 h;片劑 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0和12.0 h)由耳緣靜脈取血3 ml，并立即將其移入管壁涂有肝素鈉的離心管中，4 500 r/min離心10 min，分離得到血漿，置冰箱中保存，備用。間隔1周后交叉服藥，同法操作。

2.7.2 樣品血藥濃度的測定 取血漿樣品1 ml，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，記錄樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A s/A i)，將其代入血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算求得各時(shí)刻的血藥濃度。

2.8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8.1 血藥濃度－時(shí)間曲線 鹽酸曲馬多緩釋滴丸和普通片劑為實(shí)驗(yàn)樣品，按照上述操作對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥、取血，并對血漿樣品處理后進(jìn)行測定，根據(jù)血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度的平均值與時(shí)間的關(guān)系，繪制血藥濃度－時(shí)間曲線，見圖2。

圖2 兔體內(nèi)藥時(shí)曲線

結(jié)果緩釋滴丸與普通片的 AUC 分別為;(6 567.71 ±231.69)ng/ml·h 和(5 954.87 ±93.85)ng/ml·h;緩釋滴丸在兔體內(nèi)具有明顯的緩釋特性。與普通制劑相比，緩釋滴丸的藥時(shí)曲線比較平穩(wěn)，峰濃度明顯降低，達(dá)峰時(shí)間明顯后移。

2.8.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算 應(yīng)用孫瑞元等提供的DAS軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。對Tr緩釋滴丸和普通片的藥時(shí)曲線進(jìn)行擬合，得出兩種樣品在兔體內(nèi)的房室模型均符合一級模型。

表2 鹽酸曲馬多緩釋滴丸和普通片劑藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

從表中數(shù)據(jù)可以看出，緩釋滴丸的消除速率常數(shù)K減少，約為普通片劑的0.69倍，半衰期延長，約為普通片劑的1.81倍。

2.8.3 相對生物利用度［7］根據(jù)公式:F r=(AU C0－∞)T/(AU C0－∞)R×100% ，計(jì)算 Tr緩釋滴丸相對于普通片劑的生物利用度。其中，F(xiàn) r為相對生物利用度，(AU C0－∞)T、(AU C0－∞)R分別為測試制劑與參比制劑的藥時(shí)曲線下面積，計(jì)算結(jié)果Tr的相對生物利用度為 F r=6 567.71/5 954.87 ×100%=110.29%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測定鹽酸曲馬多緩釋滴丸血藥濃度的分析方法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好。與普通片劑相比，緩釋滴丸的血藥濃度比較平穩(wěn)，Cmax降低，Tmax后移。緩釋滴丸的Cmax、Tmax分別為542 ng/ml和5.25 h;普通片的 Cmax、Tmax分別為953 ng/ml和2 h。緩釋滴丸與普通片的相對生物利用度為110.29%。由此可見，緩釋滴丸比普通片能持久地維持更平穩(wěn)的血藥濃度，增強(qiáng)了用藥的有效性和安全性。

1 張冕，王錦軍.高效液相色譜法測定鹽酸曲馬多的血藥濃度.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(11):1629

2 屈凌波，馮書惠，吳擁軍，等.高效液相色譜法測定血漿中鹽酸曲馬多.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，34(3):574

3 S H Gan，R Ismail，W A Wan Adnan，et al.Method development and validation of a high－performance liquid chromatographic method for tramadol in human plasma using liquid － liquid extraction.Journal of Chromatography B，2002，772:123

4 Milan Nobilis，Jiri Psstera，Pavel Anzenbacher，et al.High － performance liquid chromatographic determination of tramadol in human plasma.Journal of Chromatography B，1996，681:177

5 Mohammad － Reza Rouini，Yalda Hosseinzadeh Ardakani，F(xiàn)aezeh Soltani，et al.Development and validation of a rapid HPLC method for simultaneous determination of tramadol，and its two main metabolites in human plasma.Journal of Chromatography B，2006，830:207

6 趙東祥，王彥慧，夏東亞，等.單劑量口服鹽酸曲馬多在蒙古族和漢族健康受試者的藥代動(dòng)力學(xué).中國臨床藥理學(xué)雜志，2008，24(2):126

7 趙學(xué)玲，龔顯峰，威志平，等.鹽酸曲馬多控釋片的制備及犬體內(nèi)生物利用度研究.中國新藥雜志，2008，17(6):494