于建釗

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京210093)

毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF)是指在毛細(xì)管中進(jìn)行的等電聚焦[1].CIEF是根據(jù)物質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)不同而進(jìn)行分離的.采用兩性電解質(zhì)混合物作為載體電解質(zhì)，當(dāng)在用溶質(zhì)和兩性電解質(zhì)混合溶液充滿(mǎn)的毛細(xì)管兩端加電場(chǎng)時(shí)，帶電的兩性離子和蛋白質(zhì)以不同的速度遷移通過(guò)介質(zhì)，帶正電的向負(fù)極遷移，帶負(fù)電的向正極遷移，當(dāng)它們遷移至pH=p I的區(qū)帶時(shí)，靜電荷為零，不再遷移，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為等電聚焦.CIEF是分析兩性生物分子的強(qiáng)有力工具，具有分離時(shí)間短、分辨率高、進(jìn)樣量少等優(yōu)點(diǎn).但傳統(tǒng)的CIEF使用單點(diǎn)檢測(cè)器，即使所有樣品在到達(dá)檢測(cè)器前已經(jīng)完成分離，也要等到所有聚焦區(qū)帶都通過(guò)檢測(cè)器后才能結(jié)束分離檢測(cè).從形成pH梯度到樣品聚焦完成通常只需要5 min，而聚焦區(qū)帶依次通過(guò)檢測(cè)器卻需要10～40 min，不僅增加了額外的分析時(shí)間，并且移動(dòng)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致分離譜帶展寬而影響分離度和分辨率，還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀.

全柱成像檢測(cè)(whole column imaging detection，WCID)是Pawliszyn等自1992年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)[2－7].信號(hào)可以是折射率變化、紫外吸收、激光誘導(dǎo)熒光.折射率變化檢測(cè)器是通用檢測(cè)器，但靈敏度較低，在最佳條件下對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)限僅為10－6M.激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器具有非常高的靈敏度，檢測(cè)限可達(dá)10－12M，但熒光標(biāo)記可能會(huì)使蛋白質(zhì)或肽的等電點(diǎn)改變.紫外吸收檢測(cè)器靈敏度介于前兩者之間，不需要對(duì)待測(cè)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，適用于大部分蛋白質(zhì).目前，基于紫外吸收全柱成像檢測(cè)的商品化毛細(xì)管等電聚焦儀(iCE280 Analyzer)已被推出.該儀器廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽等生物分子的微觀不均一性表征和質(zhì)量控制.

WCID克服了傳統(tǒng)CIEF的不足，采用一個(gè)動(dòng)態(tài)檢測(cè)器如電荷耦合裝置(CCD)照相機(jī)或光二極管陣列(PDA)對(duì)整個(gè)分離毛細(xì)管柱(5 cm或更短)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè).整個(gè)毛細(xì)管內(nèi)不同時(shí)間與不同位置上發(fā)生的任何事件均能得到檢測(cè).WCID不僅能對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)的分離分析，還能在分離的同時(shí)提取出有關(guān)動(dòng)態(tài)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而獲取多重信息.因此，CIEF－WCID技術(shù)在生物樣品的分離分析、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中有著廣泛的應(yīng)用前景.

1 生物樣品的分離分析

1.1 等電點(diǎn)的測(cè)定

CIEF－WCID技術(shù)可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)或其他他兩性物質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定.向待測(cè)樣品中加入等電點(diǎn)標(biāo)記物(p Imarkers)作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)比較譜圖中待測(cè)物質(zhì)峰與等電點(diǎn)標(biāo)記物峰的相對(duì)位置，即可得到待測(cè)物質(zhì)的等電點(diǎn)信息.本法測(cè)得的等電點(diǎn)，其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.01個(gè)pH單位[8].

應(yīng)用本方法，Wu等[9]實(shí)現(xiàn)了人體血紅蛋白變異體、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白4種蛋白質(zhì)樣品的分離與等電點(diǎn)測(cè)定的同時(shí)進(jìn)行.Wu等[10]使花生過(guò)敏源及其抗體的等電點(diǎn)得到驗(yàn)證，整個(gè)過(guò)程僅僅用時(shí)320 s，和凝膠等電聚焦相比大大縮短了分析時(shí)間.本方法不僅適用于蛋白質(zhì)或肽，還被用來(lái)測(cè)定病毒這種由蛋白質(zhì)包裹遺傳物質(zhì)而形成的復(fù)合體的等電點(diǎn).Goodridge等[11]測(cè)定了諾羅病毒(norovirus)的病毒樣顆粒的等電點(diǎn)，所得數(shù)據(jù)具有良好的重現(xiàn)性，且與理論計(jì)算的數(shù)值相符.

1.2 糖型的分離

應(yīng)用CIEF－WCID，Dou[12]等建立了分離促紅細(xì)胞生成素(EPO)糖型的快速高分辨分析方法(圖1).該方法不僅可以直接應(yīng)用于重組EPO的質(zhì)量控制分析，而且對(duì)體育運(yùn)動(dòng)中EPO作為興奮劑的檢測(cè)具有重要意義.

1.3 蛋白質(zhì)的快速二維表征

最近，CIEF－WCID還被用于蛋白質(zhì)的快速二維表征:首先利用毛細(xì)管等電聚焦測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，然后取消聚焦電壓，利用全柱成像檢測(cè)測(cè)定蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，進(jìn)而估算蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量.Liu[13]等選取了16種不同的氨基酸和蛋白質(zhì)(分子質(zhì)量從295～272 000)進(jìn)行測(cè)試.同經(jīng)典的二維凝膠電泳相比，本方法具有快速，易于操作，結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì).本方法可以實(shí)現(xiàn)低到中等復(fù)雜程度的蛋白質(zhì)樣品的快速二維表征.

圖1 EPO的等電聚焦圖

2 研究蛋白質(zhì)與其配體的相互作用

2.1 蛋白質(zhì)之間的相互作用

蛋白質(zhì)之間存在很強(qiáng)的相互作用時(shí)，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生改變，當(dāng)相互作用足夠強(qiáng)時(shí)就會(huì)形成蛋白質(zhì)的絡(luò)合物或者結(jié)合物.應(yīng)用全柱成像技術(shù)我們能監(jiān)測(cè)到整個(gè)過(guò)程，進(jìn)而研究蛋白質(zhì)的相關(guān)性質(zhì).Wu[14]等把牛血清白蛋白(BSA)、鏈霉親和素(streptavidin)和生物素標(biāo)記的牛血清白蛋白(biotin－labeled－BSA)作為模型蛋白，成功展示了該方法的可行性.將BSA與streptavidin混合后進(jìn)行等電聚焦，經(jīng)全柱成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與分別進(jìn)樣相比，既沒(méi)有新峰出現(xiàn)，原來(lái)兩種蛋白質(zhì)峰的位置也沒(méi)有任何改變.這表明兩種蛋白質(zhì)等電聚焦過(guò)程是相互獨(dú)立的，它們之間沒(méi)有強(qiáng)的相互作用.然而將biotin－labeled－BSA和streptavidin混合進(jìn)樣時(shí)，聚焦譜圖顯示有一新峰出現(xiàn)，這個(gè)新峰屬于二者的絡(luò)合物，由此說(shuō)明二者之間有極強(qiáng)的親和力.此方法進(jìn)一步應(yīng)用于免疫反應(yīng)的研究.例如，花生過(guò)敏原Ara hⅠ、Ara hⅡ與兔 γ－球蛋白的反應(yīng)[10].固定過(guò)敏原溶液(Ag)含量，改變?chǔ)茫虻鞍?rabbit IgG antibody，Ab)的含量，分別進(jìn)行等電聚焦，比較全柱成像譜圖可知:隨著Ab含量的增加，Ara hⅡ的聚焦區(qū)帶比Ara hⅠ的聚焦區(qū)帶先消失(圖2)，這表明在免疫反應(yīng)中Ara hⅡ與抗體的親和力更強(qiáng).此外，Liu和Pawliszyn[15]利用非共價(jià)的熒光染料(NanoOrange)標(biāo)記MS2病毒、抗體和二者形成的免疫復(fù)合體，并通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光全柱成像觀察了它們?cè)诿庖叻磻?yīng)中的改變，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)病毒與抗體的相對(duì)濃度對(duì)形成的免疫復(fù)合體的微觀不均一性有很大的影響.

圖2 花生過(guò)敏源(Ag)與兔γ－球蛋白(Ab)混合物的等電聚焦圖

2.2 蛋白質(zhì)與DNA的相互作用

近來(lái)，利用全柱成像技術(shù)建立了一種研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的新方法——?jiǎng)討B(tài)動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管等電聚焦法(dynamic kinetic capillary isoelectric focusing).該方法將相互作用的蛋白質(zhì)與DNA混合，將混合物等電聚焦，通過(guò)全柱成像觀察，蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物將會(huì)聚焦成區(qū)帶，而非結(jié)合DNA(包含未結(jié)合部分和由于離解而釋放的部分)在電場(chǎng)的作用下將遷移出分離柱.隨著復(fù)合物的離解，其峰面積將逐漸減小(圖3).利用峰面積的自然對(duì)數(shù)對(duì)離解時(shí)間作圖，即可得到相關(guān)的離解速率常數(shù).該方法成功測(cè)定了單鏈DNA結(jié)合蛋白(single－stranded DNA binding protein)和寡核苷酸(oligonucleotide，fDNA)的離解速率常數(shù)并表征了蛋白質(zhì)和DNA間的特異和非特異相互作用[16].利用該方法，核酸酶P1不能完全酶解某些DNA樣品的原因得到確認(rèn)，即:DNA與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合形成復(fù)合物，因而降低了酶解效率[17].

圖3 不同離解時(shí)間條件下SSB－fDNA復(fù)合物CIEF譜圖

2.3 蛋白質(zhì)與磷脂的相互作用

蛋白質(zhì)與磷脂之間的相互作用在蛋白質(zhì)同磷脂膜的結(jié)合過(guò)程中起著重要作用.當(dāng)磷脂與蛋白質(zhì)存在相互作用時(shí)，會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變其等電點(diǎn).應(yīng)用CIEF－WCID技術(shù)，Bo等對(duì)磷脂與蛋白質(zhì)之間的相互作用做了一系列研究[18－20].此項(xiàng)研究首先考察了7種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)與兩性卵磷脂之間的相互作用.7種蛋白質(zhì)的化學(xué)、物理性質(zhì)不同，與卵磷脂的相互作用也不同，這點(diǎn)在聚焦譜圖中得到了充分的展示.其次，鈣離子的存在會(huì)對(duì)磷脂與蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生影響.一方面，鈣離子能夠嵌入磷脂膜中，改變膜的性質(zhì).另一方面，鈣離子與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象.二者共同影響磷脂與蛋白質(zhì)之間的相互作用.之后，磷脂與蛋白質(zhì)之間相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程得到監(jiān)測(cè)，其結(jié)果表明疏水作用、靜電作用和氫鍵作用是影響蛋白質(zhì)與磷脂膜相互作用的主要因素，而蛋白質(zhì)在與磷脂膜相互作用時(shí)有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，不同結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合機(jī)理不同.

2.4 蛋白質(zhì)與藥物的相互作用

CIEF－WCID還是一種簡(jiǎn)單、方便的研究蛋白質(zhì)與藥物相互作用的方法.其研究結(jié)果為進(jìn)一步了解藥物的活性和毒性提供有用的信息進(jìn)而改善它們的臨床效果.

將藥物與靶蛋白以不同物質(zhì)的量比混合(1∶1、1∶10、1∶50、1∶100)，在37℃下反應(yīng).分別取不同反應(yīng)時(shí)間(0、0.5、1、4、6、8、12、24、48 h)的混合物進(jìn)行等電聚焦，與靶蛋白作對(duì)照.通過(guò)全柱成像觀察(圖4)，發(fā)現(xiàn)藥物的加入會(huì)使蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有所改變，并且隨著作用時(shí)間的增加，這種改變?cè)絹?lái)越明顯，蛋白質(zhì)的峰會(huì)逐漸展寬、減小直到消失.等電點(diǎn)的改變和藥物引起的蛋白質(zhì)峰的消失表明了蛋白質(zhì)與藥物之間存在很強(qiáng)的相互作用.而峰的展寬可能是由于靶蛋白與藥物有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因而生成了多種復(fù)合物.這些現(xiàn)象對(duì)研究多大藥物劑量才會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有著重要意義.此方法已應(yīng)用在含鉑抗癌藥物與人血紅蛋白(human hemoglobin)、人血清白蛋白(human serum albumin)的相互作用的研究中[21－22].

圖4 人血紅蛋白與含鉑抗癌藥物(物質(zhì)的量比1∶10)作用不同時(shí)間的譜圖

3 蛋白反應(yīng)機(jī)理的研究

蛋白反應(yīng)在生物學(xué)，生物化學(xué)和生物技術(shù)中有著重要作用.通常，蛋白質(zhì)的變性，還原，?；确磻?yīng)會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象或帶電基團(tuán)，從而引起蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的變化.因此，等電聚焦能夠很好的監(jiān)測(cè)這些反應(yīng)，提供反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)或是中間產(chǎn)物的壽命等信息.

Liu等[23]應(yīng)用CIEF－WCID技術(shù)監(jiān)測(cè)了蛋白質(zhì)變性、還原和氨基甲酰化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程.聚焦區(qū)帶清楚地顯示出反應(yīng)不同時(shí)間生成的物質(zhì)不同并且蛋白質(zhì)不完全變性的中間產(chǎn)物與完全變性產(chǎn)物相比有著更高的等電點(diǎn).當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)同尿素溶液相互作用時(shí)，其氨基甲?；a(chǎn)物得到檢出，同原蛋白質(zhì)相比其等電點(diǎn)有顯著降低(圖5).通過(guò)此種方法，這些反應(yīng)的機(jī)理得到了合理的解釋.并得出結(jié)論:在高濃度的尿素條件下，蛋白質(zhì)的變性過(guò)程可能是變性反應(yīng)和還原反應(yīng)共同作用的結(jié)果.采用CIEF－WCID對(duì)蛋白質(zhì)的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究有著顯著優(yōu)點(diǎn):首先，毛細(xì)管等電聚焦只對(duì)兩性物質(zhì)有作用，這樣就避免了非兩性物質(zhì)的干擾.其次，使用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可以獲得高的靈敏度.最后，分析時(shí)間短.每次分析只需要10 min，而常規(guī)的光譜分析法卻需要幾個(gè)小時(shí).

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間6M尿素溶液中綠色熒光蛋白的等電聚焦圖

4 結(jié)語(yǔ)

毛細(xì)管等電聚焦－全柱成像檢測(cè)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù).該技術(shù)創(chuàng)新性的將常規(guī)分離方法中單點(diǎn)檢測(cè)方式改為多點(diǎn)檢測(cè)方式，由于樣品區(qū)帶不需要轉(zhuǎn)移，因此縮短了分析時(shí)間，提高了分辨率.同時(shí)由于對(duì)分離毛細(xì)管內(nèi)的情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可以得到更多信息，如樣品的相互作用過(guò)程，擴(kuò)散系數(shù)等.因而該技術(shù)在生物分子的分離分析、蛋白質(zhì)與配體的相互作用及其機(jī)理的研究中有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用.而隨著更靈敏CCD的出現(xiàn)，熒光標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，以及在線富集技術(shù)的聯(lián)用和多功能集成化的微流控芯片的采用，毛細(xì)管等電聚焦－全柱成像檢測(cè)技術(shù)必將有著更進(jìn)一步的發(fā)展.

[1]HJERTEN S，ZHU M D.Adaptation of the Equipment for High－Performance Electrophoresis to Isoelectric－Focusing[J].Journal of Chromatography 1985，346:265－270.

[2]WU JQ，PAWLISZYN J.High－Performance Capillary Isoelectric－Focusingwith a Concentration Gradient Detector[J].Analytical Chemistry，1992，64:219－224.

[3]WU JQ，PAWLISZYN J.Capillary Isoelectric－Focusingwith a Universal Concentration Gradient Imaging－System Using a Charge－Coupled Photodiode Array[J].Analytical Chemistry，1992，64:2934－2941.

[4]WU JQ，PAWLISZYN J.Dual Detection for Capillary Isoelectric－Focusing with Refractive－Index Gradient and Absorption Imaging Detectors[J].Analytical Chemistry，1994，66:867－873.

[5]WU JQ，PAWLISZYN J.Diode Laser－Based Concentration Gradient Imaging Detector for Capillary Isoelectric－Focusing[J].Analytica Chimica Acta，1995，299:337－342.

[6]WU JQ，PAWLISZYN J.Absorption－Spectra and Multicapillary Imaging Detection for Capillary Isoelectric－Focusing Using a Charge－Coupled－Device Camera[J].Analyst，1995，120:1567－1571.

[7]WU X Z，WU JNQ，PAWLISZYN J.Fluorescence Imaging Detection for Capillary Isoelectric－Focusing[J].Electrophoresis，1995(16):1474－1478.

[8]MAO Q L，PAWLISZYN J.Capillary isoelectric focusing with whole column imaging detection for analysis of proteins and peptides[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods，1999，39:93－110.

[9]WU JQ，PAWLISZYN J.Application of Capillary Isoelectric－Focusing with Absorption Imaging Detection to the Analysis of Proteins[J].Journalof Chromatography B－Biomedical Applications，1994，657:327－332.

[10]WU X Z，HUANG TM，MULLETTW M，etal.Determination of isoelectric point and investigation of immunoreaction in peanut allergenic proteins－rabbit IgG antibody system by wholecolumn imaged capillary isoelectric focusing[J].Journal of Microcolumn Separations，2001(13):322－326.

[11]GOODRIDGE L，GOODRIDGE C，WU JQ，et al.Isoelectric point determination of norovirus virus－like particles by capillary Isoelectric focusing with whole column imaging detection[J].Analytical Chemistry，2004，76:48－52.

[12]DOU P，LIU Z，HE JG，et al.Rapid and high－resolution glycoform profiling of recombinanthuman erythropoietin by capillary isoelectric focusing with whole column imaging detection[J].Journal of Chromatography A，2008，1190:372－376.

[13]LIU Z，LEMMA T，PAWLISZYN J.Capillary isoelectric focusing coupled with dynamic imaging detection:A one－dimensional separation for two－dimensional protein characterization[J].Journal of Proteome Research，2006(5):1246－1251.

[14]WU X Z，PAWLISZYN J.Application ofWhole Column Imaging Capillary Isoelectric Focusing in Study of Protein－Protein Interaction[J].Analytical Sciences，2001(17):i189－i192.

[15]LIU Z，PAWLISZYN J.Behaviors of the MS2 virus and related antibodies in capillary isoelectric focusing with whole－column imaging detection[J].Electrophoresis，2005(26):556－562.

[16]LIU Z，DRABOVICH A P，KRYLOV SN，et al.Dynamic kinetic capillary isoelectric focusing:A powerful tool for studying protein－DNA interactions[J].Analytical Chemistry，2007，79:1097－1100.

[17]LIANG L，DOU P，DONGM M，etal.Study on a hidden protein－DNA binding in salmon sperm DNA sample by dynamic kinetic capillary isoelectric focusing[J].Analytica Chimica Acta，2009，650:106－110.

[18]BO T，PAWLISZYN J.Characterization of phospholipid－protein interactions by capillary isoelectric focusing with wholecolumn imaging detection[J].Analytical Biochemistry，2006，350:91－98.

[19]BO T，PAWLISZYN J.Role of calcium binding in protein structural changes and phospholipid－protein interactions studied by capillary isoelectric focusing with whole column imaging detection[J].Analytica Chimica Acta，2006，559:1－8.

[20]BO T，PAWLISZYN J.Dynamic process of phospholipid－protein interaction studied by capillary isoelectric focusing with whole－column imaging detection[J].Electrophoresis，2006(27):852－858.

[21]LEMMA T，MANDAL R，LIXF，et al.Investigation of interaction between human hemoglobin A(0)and platinum anticancer drugs by capillary isoellectric focusing with whole column imaging detection[J].Journal of Separation Science，2008，31:1803－1809.

[22]LEMMA T，PAWLISZYN J.Human serum albumin interaction with oxaliplatin studied by capillary isoelectric focusing with the whole column imaging detection and spectroscopic method[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，50:570－575.

[23]LIU Z，PAWLISZYN J.Capillary isoelectric focusing with laser－induced fluorescence whole column imaging detection as a tool tomonitor reactions of proteins[J].Journal of Proteome Research，2004(3):567－571.