劉萬(wàn)順,付靜蕓,常 菁,楊 艷,韓寶芹
(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島266003)
硫酸軟骨素酶(Chondroitinase)能特異地降解硫酸軟骨素為不飽和二糖及寡糖,硫酸軟骨素酶有多種重要用途,在基礎(chǔ)研究中它用來(lái)構(gòu)建二糖和寡糖的基因文庫(kù)[1],用來(lái)研究糖胺多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[2]。近年來(lái),該酶在臨床領(lǐng)域的研究非?;钴S,包括對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)代謝相關(guān)疾病,如大骨節(jié)病的防治[3],對(duì)糖胺多糖與腫瘤等疾病發(fā)生關(guān)系的研究[4],阻止玻璃體與視網(wǎng)膜的粘連[5],促進(jìn)神經(jīng)軸的再生[6]以及增強(qiáng)軟骨細(xì)胞與軟骨的粘附力[7]等。因此,對(duì)硫酸軟骨素酶的分離純化具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
微生物是硫酸軟骨素酶的主要來(lái)源,國(guó)外主要從微生物中提取硫酸軟骨素酶來(lái)獲得高純度的酶制劑,已報(bào)道的產(chǎn)酶菌株主要有普通變形桿菌(Proteus vulgaris)[8],肝 素 黃 桿 菌 (Flavobacterium heparinum)[9],奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)[10]等。目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有硫酸軟骨素酶產(chǎn)品供應(yīng),全部依靠進(jìn)口,價(jià)格昂貴。本文分離到產(chǎn)硫酸軟骨酶活力較高的菌株,對(duì)該菌進(jìn)行了初步鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化,以期為發(fā)酵制備硫酸軟骨素酶奠定一定的基礎(chǔ)。
硫酸軟骨素為市售食品級(jí),其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純商品試劑。
(1)平板分離培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基(%,w/v)(NH4)2SO41,硫酸軟骨素 0.5,NaCl 0.5,KH2PO40.03,瓊脂2,其余為水,調(diào)pH 至7.0。
(2)初篩培養(yǎng)基(%,w/v) 平板分離培養(yǎng)基+Albumin bovine V(牛血清白蛋白第五組份)1,調(diào)pH至7.0。
(3)復(fù)篩培養(yǎng)基(%,w/v) 硫酸軟骨素0.5,NaCl 0.5,KH2PO40.03,MgSO4·7H2O 0.5,以(NH4)2SO41或NaNO31或蛋白胨1或酵母粉1或牛肉膏1為氮源,其余為水,調(diào)pH至7.0。
(4)液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基(%,w/v) 蛋白胨1,硫酸軟骨素0.5,NaCl 0.5,KH2PO40.03,MgSO4·7H2O 0.5,其余為水,調(diào)pH 至7.0。
1.3.1 初篩 將采集到的土樣用無(wú)菌水進(jìn)行懸浮并稀釋,涂布平板分離培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)3~4d,劃線法將得到的單菌落在平板分離培養(yǎng)基上進(jìn)行純化;參照文獻(xiàn)[11],純化后的單菌落轉(zhuǎn)接到初篩培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)3~4d后,向平板表面倒入5mL 2mol/L的冰醋酸,觀察有無(wú)透明圈,高分子量的硫酸軟骨素具有大量的負(fù)電荷,可與小牛血清第五組分結(jié)合形成能與冰醋酸混合發(fā)生濁度反應(yīng)的復(fù)合物,硫酸軟骨素酶則會(huì)使復(fù)合物中硫酸軟骨素降解,形成透明圈,因此有透明圈則說(shuō)明有硫酸軟骨素酶活性,然后把篩選得到的有透明圈的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上保存。
1.3.2 復(fù)篩 挑取新鮮斜面種子一環(huán)接入復(fù)篩培養(yǎng)基中,30℃130r/min搖床培養(yǎng)24h,菌體密度經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)為(2~3)×107個(gè)/mL(以下種子菌液同),以2.0%的接種量接入復(fù)篩培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)72h,發(fā)酵液經(jīng)6 000r/min離心10min,取上清液測(cè)酶活,每12h測(cè)一次。
參照Saito.H[2]的方法進(jìn)行酶活力的測(cè)定。取0.1mL離心的發(fā)酵上清液、3.9mL 0.02mol/L Tris-HCl(pH=7.5)和4mL 0.2%硫酸軟骨素,加入比色管中,37℃水浴反應(yīng)20min后,立即置于沸水浴中煮沸5min,對(duì)照管以相同的條件加入滅活的發(fā)酵上清液,在232nm處測(cè)定光吸收值。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Lowry法。
酶的活力單位U定義為37℃條件下,每分鐘催化形成1μmol不飽和雙糖的酶量。相對(duì)酶活(%)是指在單因子發(fā)酵產(chǎn)酶影響試驗(yàn)中,該因子各水平發(fā)酵液的酶活力與該因子最高產(chǎn)酶水平發(fā)酵液的酶活力的比值。酶活力單位的計(jì)算公式為:
式中:A指232nm處不飽和二糖的吸光值;ε指毫摩爾消光系數(shù),一般是5.1;d指所用石英比色皿的厚度,一般是1cm;t指反應(yīng)的時(shí)間(min);Vt指反應(yīng)的總體積(mL);Vs指樣品的體積(mL)。
將復(fù)篩得到的產(chǎn)硫酸軟骨素酶活力高的菌株進(jìn)行形態(tài)、革蘭氏染色等常規(guī)檢查,并選用純化培養(yǎng)物,利用法國(guó)梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Vitek2的API 20NE手工編碼鑒定進(jìn)行生理生化特性考察。
將新鮮斜面種子挑取一環(huán)接入復(fù)篩培養(yǎng)基中,30℃,130r/min搖床培養(yǎng)24h作為種子菌液,然后以2.0%的接種量接入復(fù)篩培養(yǎng)基中,30℃,130r/min搖床培養(yǎng),每隔12h取樣測(cè)定580nm處的OD580,繪制生長(zhǎng)曲線。
1.7.1 最適碳源的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別以1.0%蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖或可溶性淀粉代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸軟骨素作為碳源,按2.0%的接種量接入種子菌液,于130r/min,30℃搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.2 最適氮源的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別以1.0%尿素、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸鈉、磷酸二氫銨或硝酸銨作為氮源,按2.0%的接種量接入種子菌液,于130r/min,30℃搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.3 最適氮源濃度的選擇 在發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別設(shè)置氮源濃度為0.5%,1.0%,1.5%和2.0%,按2.0%的接種量接入種子菌液,于130r/min,30℃搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)不同氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.4 最適培養(yǎng)基起始pH值的選擇 將發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH 值分別調(diào)至4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,8.5,9.0,9.5和10.0,按2.0%的接種量接入種子菌液,于130r/min,30℃搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)培養(yǎng)基的起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.5 培養(yǎng)基裝量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在250mL的三角瓶中,分別裝入10,20,30,40,50,60和70mL發(fā)酵培養(yǎng)基,按2.0%的接種量接入種子菌液,于130r/min,30℃搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)培養(yǎng)基裝量對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.6 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別按1.0%,2.0%,3.0%,4.0%,5.0%,6.0%(v/v)的接種量接入種子菌液,于130r/min,30℃搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.7 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 在上述優(yōu)化條件下,分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為15,20,25,28,30和32℃,于130r/min搖床培養(yǎng)48h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.8 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響 在上述優(yōu)化條件下,分別設(shè)置搖床轉(zhuǎn)數(shù)為80,100,130,150和180r/min,于最適溫度下?lián)u床培養(yǎng)48后,測(cè)定發(fā)酵液酶活力,試驗(yàn)搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響。
1.7.9 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 在以上最優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上,在250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵,分別在8,12,16,20,24,36,48,60和72h取發(fā)酵液測(cè)酶活,試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響。
2.1.1 菌株初篩結(jié)果 通過(guò)平板劃線分離篩選到2株產(chǎn)硫酸軟骨素酶能力較強(qiáng)的菌株,在以硫酸軟骨素為唯一碳源的平板分離培養(yǎng)基上在菌落周圍產(chǎn)生較大的透明圈,分別編號(hào)為5號(hào)和28號(hào),如圖1所示。沒(méi)有被酶解的大分子硫酸軟骨素能與Albumin bovine V結(jié)合并形成白色沉淀,而被菌體分泌的酶所降解形成的小分子硫酸軟骨素不能與Albumin bovine V結(jié)合,使菌落周圍能形成透明斑。
圖1 平板初篩結(jié)果Fig.1 Primary screening results of plate culture
2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果 將已純化的具有較好產(chǎn)硫酸軟骨素酶能力的2株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩,選取不同的氮源,結(jié)果顯示2種菌株在含有機(jī)氮的培養(yǎng)基中酶活都比較高,其中28號(hào)菌株在硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中也有較好的產(chǎn)酶能力,如圖2所示,故將28號(hào)菌株作為進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)菌株。
圖2 搖瓶復(fù)篩結(jié)果Fig.2 Secondary screening results of shaking culture
將經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩的28號(hào)菌株進(jìn)行菌株鑒定。
2.2.1 形態(tài)特征 菌落黃色,近圓形,表面光滑、濕潤(rùn)、不透明,邊緣整齊,略突起,直徑約0.2~0.3mm,菌體為桿狀,無(wú)孢子。
2.2.2 生理生化特征 革蘭氏反應(yīng)陰性,需氧非發(fā)酵型,氧化酶測(cè)定陽(yáng)性,可氧化利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、纖維二糖,不能利用檸檬酸鹽,甘氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶和脯氨酸芳香胺基酶呈陽(yáng)性,谷氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、脂酶和脲酶呈陰性,鑒定編碼為1601315150721001,鑒定度=99.8(既極好的鑒定)。根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果,28號(hào)菌株初步鑒定為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。
菌株生長(zhǎng)在36h之前已進(jìn)入穩(wěn)定期,之后菌體密度不再隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而有明顯增加,且處于穩(wěn)定期的時(shí)間較長(zhǎng),見(jiàn)圖3。
圖3 28號(hào)菌株生長(zhǎng)曲線圖Fig.3 Growth curve of strain 28
2.4.1 最適碳源的選擇 不同碳源的產(chǎn)酶影響如圖4所示,以硫酸軟骨素為碳源發(fā)酵液的酶活力最高,其次是乳糖、果糖、蔗糖,硫酸軟骨素是最適碳源。
圖4 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of various carbon sources on chondroitinase production
2.4.2 最適氮源的選擇 不同氮源的產(chǎn)酶影響如圖5所示,有機(jī)氮作為氮源比無(wú)機(jī)氮作為氮源更有利于產(chǎn)酶,又以酵母粉最有利于產(chǎn)酶,其次是蛋白胨和牛肉膏。
圖5 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of various nitrogen sources on chondroitinase production
2.4.3 最適氮源濃度的選擇 以酵母粉為氮源的不同氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖6所示,當(dāng)酵母粉濃度為1.0%時(shí)最有利于產(chǎn)酶。
圖6 不同氮源濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of different yeast extract concentration on chondroitinase production
2.4.4 最適培養(yǎng)基起始pH的選擇 結(jié)果如圖7所示,培養(yǎng)基的起始pH在6.0~10.0范圍內(nèi)酶活力均比較高,在pH=8.5時(shí)酶活力最高;當(dāng)pH≤4.0時(shí),酶活力很低。
圖7 培養(yǎng)基起始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of initial pH of medium on production
2.4.5 培養(yǎng)基的裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖8所示,使用250mL的三角瓶,裝量在20~60mL時(shí)產(chǎn)酶活力均較高,最適裝量為40mL。
圖8 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of liquid volumes on chondroitinase production
圖9 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of amount of inoculation on chondroitinase production
2.4.6 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖9所示,接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響不大,當(dāng)接種量為1%時(shí),酶活力最高,隨著接種量的加大,酶活力隨之降低,所以接種量為1%最有利產(chǎn)酶。
2.4.7 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖10所示,試驗(yàn)表明在20~30℃范圍內(nèi)培養(yǎng)時(shí)酶活力相對(duì)較高,發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25℃時(shí),發(fā)酵液的酶活力最高。
圖10 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effects of culture temperature on chondroitinase production
2.4.8 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖11所示,試驗(yàn)表明較高的搖床轉(zhuǎn)數(shù)不利于產(chǎn)酶,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)在80~130r/min范圍內(nèi)時(shí),酶活力比較高,以100r/min最有利于產(chǎn)酶。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)數(shù)高于130r/min時(shí),酶活力開(kāi)始降低。
圖11 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effects of revolutions per minute on chondroitinase production
2.4.9 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 結(jié)果如圖12所示,試驗(yàn)表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),酶活力不斷增加,培養(yǎng)至36h時(shí)酶活力達(dá)到最大值,之后較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酶能力都很穩(wěn)定。
圖12 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響Fig.12 Effects of culture time on chondroitinase production
本研究中,28號(hào)菌株在以硫酸軟骨素為唯一碳源的平板上生長(zhǎng)產(chǎn)生的透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)較大,搖瓶復(fù)篩的結(jié)果表明其酶活力也較高,而且以有機(jī)氮為氮源的發(fā)酵液酶活力要比無(wú)機(jī)氮的高很多。但值得注意的是,雖然5號(hào)菌株的透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)較小,搖瓶復(fù)篩結(jié)果卻表明其酶活力在有機(jī)氮中也較高,而且以牛肉膏為氮源時(shí)酶活力比28號(hào)菌株的要高。因此,菌株的D/d值的大小并不一定與液體發(fā)酵產(chǎn)酶能力的高低相對(duì)應(yīng),在篩選過(guò)程中應(yīng)結(jié)合不同的方法進(jìn)行篩選,以免漏篩產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。
通過(guò)對(duì)28號(hào)菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,該菌發(fā)酵液的酶活力可達(dá)1.2U/mL。與Yamagata[8]所報(bào)道的肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)(酶活力為0.026U/mL),普通變形桿菌(Proteus vulgaris)(酶活力為0.06U/mL)以及蘇昕等[14]報(bào)道的溫和氣單孢菌(Aeromonas sobria)(酶活力為0.92U/mL)菌株的產(chǎn)酶活性相比,28號(hào)菌株的產(chǎn)酶能力強(qiáng),并且酶活力穩(wěn)定。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性,鑒定該菌株為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌,是好氧菌,迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。Yamagata[8]所報(bào)道的產(chǎn)酶菌株分別為肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum),普通變形桿菌(Proteus vulgaris),奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)等,皆為好氧菌;蘇昕等[14]從魚(yú)腹中分離到1株產(chǎn)酶活性較高的溫和氣單孢菌(Aeromonas sobria),兼性厭氧菌;陶科等[15]從屠宰廠等地篩選到1株產(chǎn)酶活性較高的彭氏變形桿菌(P.penneri),兼性厭氧菌。
將該菌株接種在含有0.5%的硫酸軟骨素的發(fā)酵液中,與不加硫酸軟骨素的對(duì)照比較酶活,在含有硫酸軟骨素的發(fā)酵液中檢測(cè)到的酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不含硫酸軟骨素的發(fā)酵液中檢測(cè)到得酶活,故篩選得到的28號(hào)菌株所產(chǎn)的硫酸軟骨素酶屬于誘導(dǎo)酶,而且酶被菌體分泌到胞外,這有利于后期酶的分離純化。
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