王曉多 王曉理

[摘要]目的 獲得能用于中藥太子參簡單序列重復(fù)區(qū)間DNA標(biāo)記技術(shù)等分析研究的高質(zhì)量DNA。 方法 以太子參為材料，采用改良CTAB法提取太子參DNA，經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結(jié)果 改良的CTAB法能獲得高質(zhì)量的太子參DNA，OD260/OD280＞1.8，蛋白質(zhì)、多糖、RNA等去除較徹底，適于簡單序列重復(fù)區(qū)間分析。 結(jié)論 改良的CTAB法所提取太子參DNA適于簡單序列重復(fù)區(qū)間分析。

[關(guān)鍵詞] 太子參；DNA；OD值

[中圖分類號] R284.2???[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2012）15-56-02

An extraction method of genome DNA from Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm. scape for ISSR analysis

WANG?Xiaoduo1??WANG?Xiaoli2

1.Huaxi Agricultural Bureau of Guiyang City, Guiyang 550025,China;2.Wudang Agricultural Technique Service Center of Guiyang City,Guiyang 550018,China

[Abstract] Objective To extract high quality DNA from Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.for ISSR and other molecular biological analysis. Methods It was examined with ultraviolet spectrophotometer and agarose electrophoresis that the DNA was extractied by improved CTAB. Results The improved CTAB method was used to extract DNA. The purity of the extracted DNA was very high with OD260/OD280 values ＞1.8.The protein,polyhexose and RNAwere elminated completely. Conclusion The improved CTAB method was suitable for extracting DNA from Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.for ISSR analysis.

[Key words] Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.;DNA;OD value

簡單序列重復(fù)區(qū)間（ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高，可重復(fù)性和穩(wěn)定性好的特點(diǎn)[1]。為了構(gòu)建太子參[Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.]ISSR分子標(biāo)記，首先，必須從太子參中提取到高質(zhì)量的DNA。本試驗以新鮮太子參為材料，避免DNA分子的降解，采用改良CTAB法提取太子參基因組DNA，能夠除去多糖及酚類雜質(zhì)，獲得純度和產(chǎn)率可以用于ISSR分析的DNA。

1?材料與方法

1.1?供試材料

太子參（PseudosteUaria heterophylla）新鮮塊根，由貴陽醫(yī)學(xué)院生藥研究室采集并鑒定。

1.2?試劑試液

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），SDS（十二烷基磺酸鈉），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），RNase；CTAB提取緩沖液（2 g/100 mL CTAB，1.4 mol/L NaC1，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris·C1，pH 8.0）

1.3?主要儀器

低溫高速離心機(jī)（Beckman GS）；紫外/可見分光光度計（上海分析儀器廠）；凝膠成像儀（UVPGDS7600G）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠DYY28B型）。

2?方法

2.1?太子參基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB法[2]

（1）取供試材料，用重蒸水洗凈，加入液氮迅速研磨成粉末。將粉末移至1.5 mL的離心管中，加入700μL己預(yù)熱（65℃）的CTAB裂解緩沖液，混勻后置于65℃水浴1.5 h，期間輕搖幾次。

（2）水浴完成后，冷至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇（24︰1，V/V），反復(fù)顛倒數(shù)次混合，13 000 r/min，離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，再加入等體積氯仿/異戊醇（24︰1，V/V），輕輕混勻，13 000 r/min，離心10 min，上清加2/3倍體積異丙醇（預(yù)冷），混勻，可見絮狀DNA。

（3）于-20℃冰箱冷凍1 h后取出，13 000 r/min，離心5 min。棄上清，沉淀加入70%乙醇，洗滌2～3次。室溫風(fēng)干后，加入30～60μL TE溶液（pH 8.0），溶解DNA，加適量RNA酶，置37℃水浴半小時，加等體積氯仿/異戊醇（24︰1，V/V），反復(fù)顛倒數(shù)次后于13 000 r/min，離心10 min。吸取上清液于另一離心管中，加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液（pH 5.2），混勻。再加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇。輕輕顛倒幾次，在冰塊上放置10 min至絮狀DNA出現(xiàn)。10 000 r/min，離心5 min。棄上清，沉淀加入70%乙醇，洗滌2～3次。室溫風(fēng)干后，加入適量TE溶液（pH 8.0）溶解，4℃下保存。

2.2?檢測

采用0.8%瓊脂糖凝膠鋪板，電泳2 h，于裝有EB液的凝膠成像系統(tǒng)中攝像。

2.3?DNA產(chǎn)率和純度測定

取1μLDNA提取液，加1×TE稀釋50倍，用核酸蛋白儀，測定在波長260 nm 和280 nm處的吸收值，根據(jù)OD260/OD280判斷DNA純度，OD260值計算DNA提取率。

提取率=OD260×50μg×稀釋倍數(shù)（本研究中稀釋倍數(shù)為50）；DNA純度=OD260/OD280。

3?結(jié)果

提取的太子參DNA，電泳檢測點(diǎn)樣孔無殘留，條帶清晰明亮，無拖尾，分子量大約630 bp，說明太子參DNA無降解，并且RNA、蛋白質(zhì)、多糖等去除較干凈，DNA純度較高。見圖1。通過核酸蛋白儀測定，DNA濃度＞30 mg/g，OD260/OD280值＞1.8，能夠進(jìn)行ISSR分析。稀釋倍數(shù)為25；提取率按OD260×50μg×稀釋倍數(shù)（25）計算，DNA純度按OD260/OD280比值判斷。結(jié)果：DNA濃度＞30 mg/g，純度＞1.8。見表1。

3?討論

由于太子參藥材，均為產(chǎn)地加工后，經(jīng)干燥，運(yùn)輸、貯藏等環(huán)節(jié)，其DNA難免會有降解，且在塊根中含有的大量糖類、蛋白質(zhì)、酚類化合物等雜質(zhì)含量相對增高，提取的DNA常常和多糖、酚類形成共沉淀而較難分離純化，較難保證DNA的提取產(chǎn)量和純度；相反，本試驗采用從太子參新鮮根能獲得率高、純度好的DNA。

因新鮮太子參的采集受季節(jié)限制，因趕時間做太子參ISSR標(biāo)記研究，本實驗的材料為當(dāng)年新鮮出土的太子參塊根，如條件和時間允許，采集太子參新鮮幼嫩的葉等作為其DNA提取的材料，高質(zhì)量的DNA更易獲得，因新鮮幼嫩的葉等，除了DNA未降解外，糖類、蛋白質(zhì)、酚類化合物等雜質(zhì)含量很少。

植物DNA提取的方法的選擇和改良，應(yīng)根據(jù)不同的植物材料或同一植物的不同部位進(jìn)行選用[3]。本試驗以新鮮太子參為材料，采用改良CTAB的適宜方法，提取太子參基因組總DNA，采用氯仿/異戊醇（24∶1，V/V）反復(fù)沉淀，和超過12 000 r/min較長時間及多次離心、等步驟，提取到了太子參片段較完整的基因組，并且RNA、多糖、蛋白質(zhì)、酚類化合物等雜質(zhì)去除較干凈，DNA含量、純度較高，可用于ISSR分析[4]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 杜金昆，姚穎垠，倪中福，等.普通小麥、斯卑爾脫小麥、密穗小麥和輪回選擇后代材料ISSR分子標(biāo)記遺傳差異研究[J].遺傳學(xué)報，2002，29（5）：445-452.

[2] Roh MS，Cheong EJ，Choi IY，et al.（2007）Characterization of wild Prunus yedoensis analyzed by intersimple sequence repeat and chloroplast DNA[J].Scientia Horticulturae，114：121-128.

[3] 李曉波，馮波，張朝暉，等.植物藥材總DNA提取[J].中草藥，2002，33（7）：652-654.

[4] Mizukami H，Okabe Y.A simple ang rapid protocol for preparation of crude drug DNA suitable forPCR.Biol[J].Pharm Bul，1999（22）：765-766.

（收稿日期：2012-05-17）