徐 林，黃啟星，左 嬌，孔祥義，王旭初，郭安平海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?708;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?70;三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院，海南三亞57000

南繁是指秋冬季節(jié)全國各地人員到海南從事農(nóng)作物品種選育、種子生產(chǎn)和種質(zhì)鑒定等活動(dòng)。長期以來，海南省南部三亞、樂東、陵水等地形成了南繁基地。南繁地區(qū)是我國獨(dú)一無二的天然大溫室，能夠提供動(dòng)植物周年生長、繁殖的優(yōu)良自然條件(陳冠銘等，2006)，為縮短農(nóng)作物繁育年限和加速世代繁育提供了條件。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物安全評價(jià)備受關(guān)注。為保障南繁育種區(qū)的育種安全，急需在加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管的同時(shí)，研究南繁條件下轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境的影響，為開展轉(zhuǎn)基因作物育種安全評價(jià)提供支撐。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是衡量土壤質(zhì)量的指標(biāo)之一(Sharma et al.，2011)。因此，研究轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物的影響已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因作物安全評價(jià)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對其根際土壤微生物的影響已屢見報(bào)道(張美俊等，2008;Andreote et al.，2009)，但針對南繁條件下的此類研究較少(王昊等，2011)。本研究經(jīng)過對水稻3個(gè)種植周期的試驗(yàn)，探討轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤可培養(yǎng)微生物的影響，以期為在南繁區(qū)開展轉(zhuǎn)基因水稻的安全評價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 水稻品種

本研究選取轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因水稻華恢1號(hào)(TT51)為材料，以其親本水稻明恢63(MH63)為對照。2種材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 種植規(guī)格

試驗(yàn)田位于海南省三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院內(nèi)(18°18'10″N、109°24'44″E)，海拔 27 m。試驗(yàn)地為砂壤土，肥力中等偏上。試驗(yàn)地面積為30 m×20 m，周圍有圍墻隔離。轉(zhuǎn)基因水稻種植區(qū)面積(5×5)m2，株行距20 cm×20 cm，其余地塊均種植非轉(zhuǎn)基因水稻，不同水稻由田埂進(jìn)行隔離。種植期間未施用農(nóng)藥。

1.3 土壤樣品采集

在水稻種植中心區(qū)域，采用對角線采樣法隨機(jī)多點(diǎn)采樣，然后均勻混合成1個(gè)樣品。每10 d采1次樣。將土壤樣品置于室內(nèi)，自然風(fēng)干。

1.4 根際土壤理化性質(zhì)監(jiān)測

將在水稻幼苗期和收獲期采集的土壤經(jīng)20目過篩后，分別對其理化性質(zhì)進(jìn)行測定。測定指標(biāo)包括pH，全氮、堿解氮、全磷、速效磷、全鉀、速效鉀等含量。該部分試驗(yàn)委托中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心檢測。

1.5 土壤微生物培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法(沈萍等，1999)對土壤微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)菌、放線菌和真菌分別用牛肉膏蛋白胨、高氏一號(hào)和孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用人工計(jì)數(shù)方法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算每克干土中的菌落數(shù)/(CFU·g－1)。

1.6 細(xì)菌種屬鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)，從每個(gè)樣品中挑選30個(gè)單菌落進(jìn)行平板劃線純化。提取菌體DNA，使用16S通用引物27F、1492R(王昊等，2011)對細(xì)菌、放線菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用AxyPrep DNA gel extraction Kit回收目的條帶，送上海生工生物工程公司測序。采用BLAST序列比對方法，將測序結(jié)果與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步鑒定到屬一級。

1.7 土壤線蟲的計(jì)數(shù)

參考王昊等(2011)報(bào)道的方法統(tǒng)計(jì)土壤線蟲數(shù)量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Microsoft excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test等統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤理化性質(zhì)

由表1可以看出，水稻收獲期與幼苗期相比，TT51和MH63都存在以下情況:土壤pH略有上升;全氮含量基本未發(fā)生變化;堿解氮含量明顯上升;全磷含量大幅度降低;速效磷、速效鉀含量均明顯上升。不同的是，TT51幼苗期土壤的有機(jī)質(zhì)少于收獲期，而MH63則相反;TT51收獲期全鉀含量高于幼苗期，而MH63在2個(gè)時(shí)期的全鉀含量變化較小。此外，在幼苗期或收獲期，TT51與MH63各土壤理化指標(biāo)的差異較小，說明TT51對其根際土壤理化性質(zhì)的影響較小。

表1 水稻幼苗期和收獲期土樣理化性質(zhì)Table 1 Chemical properties of soil sampled at the start of the experiments and after the growth of non-transgenic rice and transgenic rice at the Plant Breeding Base of Hainan

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物數(shù)量組成的影響

由表2可以看出，細(xì)菌方面，在3個(gè)種植周期(42個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn))中，有16個(gè)監(jiān)測點(diǎn)出現(xiàn)明顯變化。TT51根際土壤細(xì)菌群落數(shù)量顯著高于對照MH63的監(jiān)測點(diǎn)有7個(gè)(P＜0.05)，其中，極顯著高于對照的監(jiān)測點(diǎn)有3個(gè)(P＜0.01);TT51根際土壤細(xì)菌群落數(shù)量顯著低于MH63的監(jiān)測點(diǎn)有9個(gè)(P＜0.05)，其中，極顯著低于對照的監(jiān)測點(diǎn)有3個(gè)(P＜0.01)。

真菌方面，在3個(gè)種植周期(42個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn))中，有21個(gè)監(jiān)測點(diǎn)出現(xiàn)明顯變化。TT51根際土壤真菌數(shù)量顯著高于對照MH63的監(jiān)測點(diǎn)有5個(gè)(P＜0.05)，其中，極顯著高于對照的監(jiān)測點(diǎn)有3個(gè)(P＜0.01);TT51根際土壤真菌數(shù)量顯著低于MH63的監(jiān)測點(diǎn)有16個(gè)(P＜0.05)，其中，極顯著低于對照的監(jiān)測點(diǎn)有7個(gè)(P＜0.01)。

放線菌方面，在3個(gè)種植周期(42個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn))中，有20個(gè)監(jiān)測點(diǎn)出現(xiàn)明顯變化。TT51根際土壤放線菌數(shù)量顯著高于對照MH63的監(jiān)測點(diǎn)有10個(gè)(P＜0.05)，其中，極顯著高于對照的監(jiān)測點(diǎn)有8個(gè)(P＜0.01);TT51根際土壤放線菌數(shù)量顯著低于MH63的監(jiān)測有10個(gè)(P＜0.05)，其中，極顯著低于對照的監(jiān)測點(diǎn)有3個(gè)(P＜0.01)。

此外，通過連續(xù)3個(gè)種植周期監(jiān)測水稻根際土壤微生物種群數(shù)量，發(fā)現(xiàn)土壤微生物種群數(shù)量變化與水稻生育期之間無明顯相關(guān)性。TT51與對照MH63根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量變化趨勢相似。從總體上看，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物數(shù)量未造成明顯影響。僅有個(gè)別監(jiān)測時(shí)間點(diǎn)顯示兩者間存在明顯差異，但變化不成規(guī)律，這可能是由于采樣和計(jì)數(shù)誤差造成。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤微生物物種組成的影響

采集第一種植周期水稻收獲時(shí)的土壤，分別用牛肉膏蛋白胨、高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化細(xì)菌、放線菌。分子鑒定及與GenBank序列BlastN比對結(jié)果顯示，TT51與MH63細(xì)菌種類大體相同，為芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、鏈霉菌屬Streptomyces(表3)。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻對根際土壤線蟲的影響

在第三種植周期(14個(gè)監(jiān)測時(shí)間點(diǎn))中，有6個(gè)監(jiān)測點(diǎn)出現(xiàn)明顯變化。TT51根際土壤線蟲數(shù)量顯著高于對照MH63的監(jiān)測點(diǎn)有5個(gè)，MH63根際土壤線蟲數(shù)量顯著高于TT51的監(jiān)測點(diǎn)有1個(gè)(圖1)。

3 結(jié)論與討論

本研究在南繁條件下連續(xù)2年對轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac水稻根際土壤可培養(yǎng)微生物群落數(shù)量動(dòng)態(tài)進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51對根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌的群落數(shù)量沒有明顯影響，這與 Kim et al.(2008)和 Wu et al.(2009)的研究結(jié)果一致。此外，Lee et al.(2011)運(yùn)用T-RFLP和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對轉(zhuǎn)基因水稻的根際細(xì)菌、真菌群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻不會(huì)對土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。然而，楊保軍等(2009)認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量顯著高于非轉(zhuǎn)Bt基因水稻MH63，并且轉(zhuǎn)Bt基因水稻對根際細(xì)菌數(shù)量的影響與水稻生育期相關(guān)。本研究中僅有部分監(jiān)測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻與其對照的根際土壤微生物數(shù)量存在明顯差異，其中既有轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物數(shù)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因的情況，也有相反的情況，但總體變化趨勢一致。這可能是由平板計(jì)數(shù)的技術(shù)特點(diǎn)和大田試驗(yàn)中多種不可控條件(如氣候、溫度)等因素造成。因此，目前獲得的初步結(jié)論仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 水稻根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌群落數(shù)量變化Table 2 Population dynamics of bacteria，fungi and actinomyces isolated from rice rhizosphere soil

表3 水稻根際土壤細(xì)菌序列BlastN比對結(jié)果Table 3 BlastN results of rice rhizosphere soil bacterial sequences

圖1 水稻根際土壤線蟲群落數(shù)量變化Fig.1 Population dynamics of nematode isolated from rice rhizosphere soil

土壤微生物種屬鑒定結(jié)果顯示，TT51與MH63根際主要微生物類群一致。但由于在常規(guī)培養(yǎng)條件下，土壤中可培養(yǎng)微生物不到其總量的1%，僅鑒定出3個(gè)屬，即芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、假單胞菌屬。經(jīng)過連續(xù)3個(gè)種植周期的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)種植轉(zhuǎn)基因水稻短期不會(huì)對其根際土壤微生物種類構(gòu)成產(chǎn)生明顯影響，也不會(huì)對根際微生物產(chǎn)生累積影響。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是土壤生態(tài)監(jiān)測的重要內(nèi)容，因此，轉(zhuǎn)基因作物對其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響還有待進(jìn)一步研究，特別是采用新技術(shù)(如宏基因組測序)對不可培養(yǎng)微生物的研究。此外，植物主要通過植物組織(包括植物殘茬和花粉)(Icoz ＆ Stotzky，2008;Wu et al.，2009)和根部分泌物(Bardgett et al.，1999)影響土壤微生物的多樣性。轉(zhuǎn)基因植物組織降解后，具有生物活性的外源片段有可能向土壤微生物發(fā)生基因橫向轉(zhuǎn)移(Pontiroli et al.，2009)，從而使土壤微生物獲得新的性狀，進(jìn)而改變土壤微生物多樣性(包括生物多樣性和功能多樣性)，造成潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，后續(xù)研究還可采取ELISA等技術(shù)探討外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物對土壤微生物的影響(付慶靈，2011)。

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