梁 冰，劉曉冬，徐慧英，信 瑞，孔德娟，賀夢子，賈立立，徐 波，馬淑梅

(吉林大學公共衛(wèi)生學院 衛(wèi)生部放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021)

子宮頸癌是僅次于乳腺癌的全球第二種最常見的婦科惡性腫瘤，而且發(fā)展中國家所占發(fā)病比例極高(> 80%)[1]，嚴重危害婦女的健康與生命。目前，放療作為宮頸癌治療的常規(guī)手段，廣泛地應(yīng)用于臨床，而化療因其作用效果存在爭議，應(yīng)用范圍較小。據(jù)統(tǒng)計約有80%的宮頸癌患者需要以放射治療作為單獨治療或綜合治療，雖然早期患者放射治療效果較好，但是中、晚期患者的治療效果仍較差，主要原因是輻射敏感性不理想等問題。因此，如何提高腫瘤的放射敏感性，成為當前宮頸癌治療的關(guān)鍵問題之一。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)某些基因的表達在分子水平上影響著腫瘤細胞的放射敏感性。脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,DCK)是脫氧核苷酸生物合成補救途徑中的關(guān)鍵酶，在維持正常的脫氧核苷庫方面起著重要的生理學作用。大量研究[2-3]發(fā)現(xiàn)：電離輻射和其他基因毒性因子刺激可引起細胞DCK激酶活性增高而促進DNA損傷的修復(fù)。目前，有關(guān)RNA干擾技術(shù)沉默HeLa細胞DCK基因改變其放化療敏感性的研究尚未見報道。本研究利用干擾技術(shù)特異性地阻斷DCK 基因在宮頸癌細胞中的表達，觀察其對人宮頸癌細胞藥物敏感性及輻射敏感性的影響，為宮頸癌的基因治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器實時定量PCR所需引物及RNAiso plus、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(熒光為SYBR Green Ⅰ)等均購自大連寶生物公司。DCK一抗為英國Abcam公司產(chǎn)品；GAPDH一抗、增強化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒等為Santa Cruz 公司產(chǎn)品；羊抗兔及兔抗鼠二抗購自北京中山金橋公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與照射人宮頸癌細胞HeLa由本實驗室保存，用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS及青霉素與鏈霉素各100 U·mL-1)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。照射采用國產(chǎn)X.S.S.205(FZ)型固定式X射線深部治療機，濾板0.5 mm Cu+1.0 mm Al。照射條件為靶皮距600 mm，吸收劑量率0.41 Gy·min-1。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染細胞計數(shù)并在含血清、但不含抗生素的正常培養(yǎng)基中鋪板，轉(zhuǎn)染當天細胞密度達到50%～80%。取FuGENE 6 30 μL，用無血清培養(yǎng)基稀釋到100 μL，混勻孵育5 min，10 μg DCK siRNA質(zhì)粒(由美國Methodis Hospital Research Institute，徐教授惠贈)用無血清培養(yǎng)基稀釋至100 μL，二者混勻并孵育30 min，逐滴加入HeLa細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后用濃度為1 mg·L-1嘌呤霉素篩選至陽性克隆出現(xiàn)。

1.4 實時定量PCR檢測DCK基因表達根據(jù)GenBank中序列設(shè)計引物，目的基因引物序列：DCK，5′-TGCAGGGAAGTCAACATT-3′和5′- TCCCACCATTTTTCTGAG-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列，5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和5′-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3′。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性20 s，60℃退火延伸20 s；循環(huán)45次。以假照組為校正樣本，按照ΔΔCt解析法來進行目的基因與管家基因的相對定量。

1.5 Western blotting檢測DCK蛋白的表達收集細胞，加入適量含有PMSF單去污裂解液，冰浴30 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清移入新Ep管中。蛋白煮沸5 min進行變性，用10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗于 4°C搖床過夜，二抗反應(yīng)90 min，ECL化學發(fā)光法顯色，X光膠片顯影。

1.6 細胞增殖情況測定取指數(shù)生長期的3組細胞，計數(shù)后按1×104接種于12孔板內(nèi)，分別于24、48、72、96、120、144、168、192 h計數(shù)孔內(nèi)細胞總數(shù)，每個時間點設(shè)3個復(fù)孔。

1.7 MTT檢測細胞藥物敏感性將空白對照組、陰性對照組及DCK siRNA組的HeLa細胞以4 000個/孔數(shù)量接種于96孔板。AraC藥物組：濃度分別為0、0.05和0.1 μmol·L-1；每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，藥物作用48 h后檢測細胞存活率。選擇490 nm波長，酶標儀測定各孔吸光度(A)值，細胞存活率(%)=實驗組A值 /對照組A值×100%，設(shè)對照組細胞存活率為1。

1.8 克隆形成實驗檢測細胞輻射敏感性將750、2 000、4 000、6 000、8 000個/皿細胞分別接種于6孔板中，每組均設(shè)3復(fù)孔，分別照射0、2、4、6、8 Gy，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，棄掉培養(yǎng)基，PBS小心清洗，甲醇固定30 min，GIEMSA染色10 min，自然晾干后計數(shù)≥50個細胞的單克隆數(shù)，計算克隆形成率及存活分數(shù)。克隆形成率(%)=(克隆細胞數(shù)/接種細胞數(shù))×100%，存活分數(shù)=照射后細胞的克隆形成率/未受照射細胞的克隆形成率。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染前后細胞中DCK mRNA的表達實時定量PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染HeLa后，siRNA組DCK mRNA表達水平(0.38±0.08)與空白對照組及陰性對照組(1.00±0.12和0.89±0.15)比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2個對照組間DCK mRNA表達水平接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明DCK siRNA對DCK基因的干擾沉默作用具有特異性。

2.2 轉(zhuǎn)染前后細胞中DCK蛋白的表達Western blotting結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后siRNA組DCK蛋白表達水平(0.22±0.05)與空白對照組及陰性對照組(1.00±0.07和0.96±0.12)比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2個對照組間DCK蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與DCK mRNA的表達結(jié)果一致。見圖1。

圖1 DCK蛋白表達結(jié)果

2.3 細胞增殖情況測定結(jié)果為了比較空白對照組、陰性對照組及DCKsiRNA組的HeLa細胞生長速度是否存在差異，采用細胞計數(shù)的方法對不同時間的3組細胞的增殖進行監(jiān)測，結(jié)果顯示:3組細胞的增殖速度接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同時間各組HeLa細胞的增殖情況

2.4 沉默DCK后Hela細胞藥物敏感性的變化MTT結(jié)果顯示： AraC藥物作用后48 h，siRNA組細胞存活分數(shù)明顯高于陰性對照組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而2個對照組HeLa細胞的細胞存活分數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同劑量AraC作用下HeLa細胞的存活分數(shù)

2.5 沉默DCK后宮頸癌細胞輻射敏感性的變化克隆形成結(jié)果顯示：siRNA組細胞存活分數(shù)明顯少于陰性對照組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而2個對照組HeLa細胞的細胞存活分數(shù)無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 不同劑量電離輻射作用下HeLa細胞的存活分數(shù)

3 討 論

DCK基因位于染色體的 4q13.3-q21.1,約含有2 618 bp,是一種相對分子量為61 000的磷酸激酶，包括2個30 500的相同亞基。DCK表達水平具有組織特異性，胸腺和白血病的T淋巴細胞中的DCK活性要比其他類型細胞中同一種酶的活性高。其主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，集中在細胞核周圍和細胞膜區(qū)域，如果DCK過量表達，則主要集中在細胞核內(nèi)。DCK作為磷酸激酶，顯示出廣泛的底物特異性，除了自然產(chǎn)生的dAdo、dGuo及dCyd外，DCK還是AraC、CNDAC等核苷類化療藥物活化的限速酶和關(guān)鍵酶。DCK 活性降低或喪失,可導(dǎo)致細胞對一系列化療藥物產(chǎn)生耐藥。研究[4-6]表明：腫瘤耐藥細胞中存在一個或多個DCK基因結(jié)構(gòu)的突變，或者基因的高度甲基化，導(dǎo)致DCK表達降低或不表達，從而使AraC和CNDAC等藥物活化受抑制，導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物敏感性降低。有學者用逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒將DCK基因?qū)爰毎黾覦CK的活性,可以提高細胞對藥物的敏感性。動物實驗[7]也顯示：通過基因轉(zhuǎn)染方式增加DCK活性，動物在給予抗癌藥吉西他濱后，腫瘤體積縮小。本實驗結(jié)果顯示：DCK siRNA組細胞中DCK mRNA及蛋白的表達水平與空白對照組及陰性對照組比較明顯降低；細胞計數(shù)法檢測結(jié)果提示，沉默DCK基因?qū)毎L無明顯影響；AraC作用48 h后siRNA組中細胞存活分數(shù)明顯高于陰性對照組及空白對照組，由于DCK被沉默后降低AraC藥物磷酸化，抑制其活化，進而減弱細胞毒性作用[8-9]。提示沉默DCK的HeLa細胞對AraC的藥物敏感性降低。

放射治療是惡性腫瘤治療的主要手段，單純放射治療常導(dǎo)致治療失敗，加大放療劑量則導(dǎo)致正常組織的放射性損傷，研究[10]表明：腫瘤細胞對放療的敏感性可能是決定放射治療療效的關(guān)鍵因素。影響腫瘤放射敏感性的因素有很多，包括DNA雙鏈斷裂修復(fù)效率、細胞周期阻滯和細胞凋亡等，由于電離輻射對DNA的主要損傷形式是DNA雙鏈斷裂，所以DNA 雙鏈斷裂修復(fù)效率被認為是影響放療敏感性的首要決定因素[11]。研究顯示：DCK與腫瘤細胞放射敏感性密切相關(guān)；van Den Neste等[12]發(fā)現(xiàn)：用B-CLL細胞經(jīng)30 J·m-2UV-C照射30 min后，DCK活性增高3倍，細胞進行積極的DNA損傷修復(fù)，證明DCK活性上調(diào)有助于細胞對UV引起的DNA損傷修復(fù)，因此,DCK可能是腫瘤細胞放射增敏的理想靶點。本實驗結(jié)果顯示：不同劑量電離輻射照射后DCK siRNA組細胞存活分數(shù)與對照組比較顯著降低，可能是DCK基因的沉默降低了天然脫氧核苷酸底物磷酸化程度，減少了DNA合成補救途徑所需的dNTPs底物[13]，DNA損傷修復(fù)無法完成，使輻射敏感性增加。

本實驗結(jié)果表明：siRNA阻斷DCK mRNA及蛋白的表達，可以降低宮頸癌細胞對藥物的敏感性及提高對輻射的敏感性，DCK可以作為對宮頸癌治療的一個潛在靶點。

[參考文獻]

[1]Costa LS,Telles CB,Oliveira RM,et al.Heterofucan from Sargassum filipendula induces apoptosis in HeLa cells [J].Mar Drugs,2011,9(4): 603-614.

[2]Sigmond J,Haveman J,Kreder NC,et al.Enhanced activity of deoxycytidine kinase after pulsed low dose rate and single dose gamma irradiation [J].Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,2006,25(9-11):1177-1180.

[3]Haveman J,Sigmond J,van Bree C,et al.Time course of enhanced activity of deoxycytidine kinase and thymidine kinase 1 and 2 in cultured human squamous lung carcinoma cells,SW-1573,induced by gamma-irradiation [J].Oncol Rep,2006,16(4):901-905.

[4]van Bree C,Castro-Kreder N,Loves WJ,et al.Sensitivity to ionizing radiation and chemotherapeutic agents in gemcitabine-resistant human tumor cell lines[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2002,54(1):237-244.

[5]Song JH,Kim SH,Kweon SH,et al.Defective expression of deoxycytidine kinase in cytarabine-resistant acute myeloid leukemia cells[J].Int J Oncol,2009,34(4):1165-1171.

[6]Qin T,Jelinek J,Si J,et al.Mechanisms of resistance to 5-aza-2′-deoxycytidine in human cancer cell lines[J].Blood,2009,113(3):659-667.

[7]Braess J,Voss S,Jahns-Streubel G,et al.The pharmacodynamic basis for the increased antileukaemic efficacy of cytosine arabinoside-based treatment regimens in acute myeloid leukaemia with a high proliferative activity[J].Br J Haematol,2000,110(1):170-179.

[8]Réjiba S,Bigand C,Parmentier C,et al.Gemcitabine-based chemogene therapy for pancreatic cancer using Ad-dCK:UMK GDEPT and TS/RRsiRNA strategies [J].Neoplasia,2009,11(7):637-650.

[9]Sigmond J,Bergman AM,Leon LG,et al.Staurosporine increases toxicity of gemcitabine in non-small cell lung cancer cells: role of protein kinase C,deoxycytidine kinase and ribonucleotide reductase[J].Anticancer Drugs,2010,21(6):591-599.

[10]吳曉芬,洪承皎,郭文秀,等.槲皮素對HeLa細胞輻射敏感性影響及其機理[J].輻射研究與輻射工藝學報,2011,29(2):104-108.

[11]Mondello C,Smirnova A,Giulotto E.Gene amplification,radiation sensitivity and DNA double-strand breaks[J].Mutat Res,2010,704(1-3):29-37.

[12]van Den Neste E,Smal C,Cardoen S,et al.Activation of deoxycytidine kinase by UV-C-irradiation in chronic lymphocytic leukemia B-lymphocytes[J].Biochem Pharmacol,2003,65(4):573-580.

[13]Keszler G,Szikla K,Kazimierczuk Z,et al.Selective activation of deoxycytidine kinase by thymidine-5′-thiosulphate and release by deoxycytidine in human lymphocytes[J].Biochem Pharmacol,2003,65(4):563-571.