王榮琦 李建梅 南月敏 米紅梅 趙素賢 孔令波 任偉光

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是非酒精性脂肪性肝病病程進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)，是單純性脂肪肝發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路［1］，有效阻止其發(fā)生及進(jìn)展是該病治療的關(guān)鍵。殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，具有降血脂、提高免疫力、防癌、防治糖尿病、促進(jìn)傷口愈合等多種生物功能［2］，但其在NASH中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究以蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine and choline deficient，MCD)飲食建立小鼠NASH模型，采用殼聚糖中藥復(fù)方進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察其對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)表達(dá)的影響，為NASH治療策略的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 MCD及蛋氨酸-膽堿充足飼料均購于美國ICN生物醫(yī)學(xué)化學(xué)藥品公司;殼脂膠囊(成分為甲殼、制何首烏、茵陳、丹參、牛漆)由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司提供，國藥準(zhǔn)字：Z20050665。TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購于北京華美生物工程公司?？俁NA提取試劑盒、RNA酶抑制劑、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶購于Promega公司。引物序列依據(jù)Gen-Bank設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。

1.2 模型建立及標(biāo)本采集 清潔級7～8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠18只，體重18～20 g，購于白求恩國際和平醫(yī)院動物室，隨機(jī)分為3組，每組 6只。對照組以 DL-蛋氨酸(3 g/kg)和氯化膽堿(2 g/kg)充足的飼料喂養(yǎng);模型組以膽堿、蛋氨酸缺乏的高脂飼料(MCD)喂養(yǎng);干預(yù)組在MCD飲食基礎(chǔ)上加用殼聚糖中藥復(fù)方溶液0.7 g/kg灌胃，每日1次(殼脂膠囊常溫陰涼密閉保存，臨用前根據(jù)小鼠體重取所需量，將膠囊成分溶于蒸餾水2 ml中制成殼聚糖中藥復(fù)方溶液)。4周末在深度麻醉下處死各組小鼠，留取血清和肝組織。部分肝組織用10%甲醛固定，備做石蠟切片;余肝組織用液氮快速冷凍，-80℃保存，備提取RNA。

1.3 血清學(xué)檢測指標(biāo)及方法 用日本Olympus AU 2700全自動生化分析儀酶法測定血清ALT、TC和TG水平;采用雙抗體夾心ABC-酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清TNF-α、IL-6濃度，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4 肝組織病理學(xué)觀察 甲醛固定肝組織標(biāo)本，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》［3］光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織脂肪變和炎癥活動程度。

1.5 肝組織TNF-α、IL-6 mRNA檢測 應(yīng)用實(shí)時定量PCR。引物設(shè)計(jì)：TNF-α 上游 5’-GAACTGGCAGAAGAGGCACT，下游5’-AGAAGAGGCTGAGACATA GG C-3’;IL-6 上游 5’-TACCACTCCCAACAGACCTG-3’，下游 5’-TCTCATTTCCA CGATTTCCCAG-3’。采用Trizol試劑提取肝組織總RNA，以寡脫氧核苷酸和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。用Taq DNA多聚酶PCR擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物，應(yīng)用ABI PRISM 7000序列檢測系統(tǒng)測定mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)，計(jì)算mRNA拷貝和循環(huán)數(shù)的線形關(guān)系，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依此計(jì)算實(shí)驗(yàn)標(biāo)本mRNA的拷貝數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用Student-Newman-Keuls法進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血清ALT、TC和TG水平的變化 與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、TC和TG水平均顯著增高(P＜0.01)。干預(yù)組小鼠血清ALT、TC和TG水平較模型組明顯降低(P ＜0.01)。見表1。

2.2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6含量變化比較 造模4周后，與對照組相比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6含量均明顯增高(P＜0.01)，干預(yù)組小鼠血清TNF-α、IL-6含量較模型組顯著下降(P＜0.01)。見表2。

表1 3組實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT、TC和TG水平n=6，±s

表1 3組實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT、TC和TG水平n=6，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

組別 ALT(U/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L)34±6 1.45±0.27 0.57±0.05模型組 115±7* 4.56±0.57* 1.17±0.11*干預(yù)組 75±6# 2.96±0.28# 0.91±0.08對照組#

表2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6含量n=6，pg/ml，±s

表2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6含量n=6，pg/ml，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

IL-6對照組組別 TNF-α 13.6±0.9 22.6±2.5模型組 32.6±1.1* 34.3±1.2*干預(yù)組 22.8±0.9# 27.0±1.2#

2.3 3組小鼠肝組織病理變化 對照組小鼠肝組織病理學(xué)無明顯異常。模型組小鼠肝組織可見大泡性脂肪變、氣球樣變，小葉內(nèi)可見點(diǎn)狀或灶狀炎細(xì)胞浸潤、壞死(箭頭所示)，殼聚糖中藥復(fù)方組小鼠肝組織脂肪變、炎癥程度較模型組明顯減輕(圖1)。

圖1 3組小鼠肝細(xì)胞脂肪變、炎癥活動情況(HE×200)

2.4 3組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)比較 與對照組相比，模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);與模型組相比，干預(yù)組小鼠肝組織 TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.01)。見表3。

表3 3組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)n=6，±s

表3 3組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)n=6，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

mRNA IL-6 mRNA對照組組別 TNF-α 1.13±0.13 1.13±0.12模型組 4.83±0.37* 4.02±0.52*干預(yù)組 3.28±0.39# 2.58±0.54#

3 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)的西化和生活方式的改變，NASH的發(fā)病率日益增高［4］，美國有將近1/3成年人患有NASH，我國的發(fā)病率約占15%［5］。其發(fā)病率在肥胖、糖尿病、高血壓人群中更高。大量研究顯示，NASH不僅可導(dǎo)致嚴(yán)重肝病，而且與動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的高發(fā)密切相關(guān)。因此，非酒精性脂肪性肝炎的有效防治對于阻止慢性肝病的進(jìn)展并改善預(yù)后具有十分重要的意義。目前臨床缺乏高效、無毒副作用的抗脂肪性肝炎的西藥，中藥復(fù)方凸顯了其多組分、多途徑、多靶點(diǎn)的治療作用，成為目前研究的熱點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中采用MCD飲食喂養(yǎng)雄性C57BL/6J小鼠4周后，與對照組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大泡性脂肪變、肝小葉內(nèi)可見點(diǎn)狀或灶狀炎性細(xì)胞浸潤和壞死，同時血清ALT、TC和TG水平明顯升高，說明MCD飲食成功誘導(dǎo)出了具有典型臨床特征的NASH模型。血清ALT水平是代表肝損傷的靈敏指標(biāo)［6］，主要存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，能夠反映肝細(xì)胞的完整性，其水平增高往往說明肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損。應(yīng)用殼聚糖中藥復(fù)方預(yù)處理后，肝脂肪變性、炎癥反應(yīng)程度明顯減輕，并能一定程度上抑制轉(zhuǎn)氨酶的升高，顯示其對肝臟具有一定的保護(hù)作用。

肝臟是體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝的重要場所，各種致病因素如長期高脂飲食可通過一個或多個環(huán)節(jié)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)TC、TG的異常堆積。其中TG是NASH患者肝臟內(nèi)蓄積的主要脂質(zhì)，而TC和游離脂肪酸，特別是蓄積于線粒體內(nèi)的部分，作為攻擊性脂質(zhì)可以促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和TNF-α的激活，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟損傷。因此，肝臟脂肪沉積是發(fā)生脂肪性肝炎的前提條件，輕微的重疊損傷就可誘發(fā)其產(chǎn)生NASH［7］。本研究中，模型組小鼠血清 TC、TG明顯增加，肝組織病理出現(xiàn)大泡性脂肪變，說明肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生了障礙，導(dǎo)致肝臟脂肪浸潤及脂肪性肝炎。干預(yù)組小鼠血清TC、TG水平較模型組均明顯下降，說明殼聚糖可減少肝內(nèi)脂肪沉積、改善脂質(zhì)代謝紊亂。其降脂的可能機(jī)制為：殼聚糖具有粘滯性，在胃中能與胃酸作用形成凝膠，從而延緩胃排空;吸附膽汁酸和膽固醇，減少腸道對膽固醇和膽汁酸的吸收;刺激腸道食物源性脂質(zhì)的排泄，從而達(dá)到治療 NASH的效果［8，9］。

近年來，細(xì)胞因子在肝臟疾病中的作用已受到密切關(guān)注。從肝細(xì)胞脂肪變性到脂肪性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化的進(jìn)展過程中，TNF-α、IL-6、瘦素、脂聯(lián)素、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)等細(xì)胞因子都起了重要作用［10］。TNF-α是具有免疫效應(yīng)和炎性反應(yīng)雙重作用的細(xì)胞因子，在肝臟主要由激活的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α可促進(jìn)外周組織脂肪動員，使血中游離脂肪酸增加，肝細(xì)胞TG的合成及聚集增加［11］;而增加的游離脂肪酸又可使TNF-α表達(dá)增加，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)而觸發(fā) IL-6 等細(xì)胞因子的分泌和ROS產(chǎn)生增多，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜破壞和炎癥反應(yīng)，形成一個自我反饋的惡性循環(huán)［12］。TNF-α表達(dá)水平與體內(nèi)脂質(zhì)含量、肥胖程度及胰島素抵抗程度呈正相關(guān)［13］。IL-6亦是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于脂肪組織、肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞等中。IL-6可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放 TNF-α，刺激肝細(xì)胞分泌 C-反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原而發(fā)揮致病作用。有研究表明，NASH患者肝臟IL-6的表達(dá)較單純性脂肪肝患者明顯升高，且升高的IL-6可促進(jìn)脂肪酸分解和游離脂肪酸的釋放，直接增加肝臟TG的貯積，與TC、TG關(guān)系密切［14-16］。本研究顯示，采用MCD飲食喂養(yǎng)小鼠4周后，模型組小鼠肝組織和血清中TNF-α與IL-6的含量較對照組明顯升高，表明TNF-α和IL-6參與了脂肪性肝炎的形成與進(jìn)展過程。應(yīng)用殼聚糖中藥復(fù)方干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)小鼠無論是血清中TNF-α、IL-6的含量還是肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平均較模型組明顯下降，說明殼聚糖中藥復(fù)方可降低TNF-α和IL-6的分泌，減少炎性細(xì)胞的浸潤，繼而發(fā)揮治療NASH的作用。Zhou等［17］亦證實(shí)，殼聚糖可通過影響脂肪源性激素TNF-α、瘦素等的分泌來增加胰島素的敏感性，從而緩解胰島素抵抗，與我們的研究結(jié)果相似。

綜上所述，殼聚糖中藥復(fù)方可通過改善肝功能、糾正脂代謝紊亂、抑制TNF-α和IL-6的分泌、減輕炎性反應(yīng)等多種途徑來阻止或延緩NASH的發(fā)生發(fā)展，是防治脂肪性肝病的有效措施之一。

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