崔宏偉， 孫劍萍， 劉春燕， 文景芝＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系，哈爾濱 150030；2.牡丹江煙草科學(xué)研究所，牡丹江 157011；3.黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心，哈爾濱 150090）

煙草野火病是由Pseudomonas syringae pv.tabaci（Wolf et Foster）Young，Dye et Wilkie引起的一種細(xì)菌性病害。20世紀(jì)80年代以來(lái)，該病在我國(guó)的主要煙區(qū)均大面積發(fā)生，并有逐年加重的趨勢(shì)，造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。迄今為止，對(duì)該病的防治主要依靠農(nóng)用鏈霉素，無(wú)論是在苗期還是大田都取得了較好的防治效果［2］。但由于十多年的連續(xù)使用，病原菌已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性，因此，提高煙草自身的抗病性對(duì)防治野火病具有重要意義。目前，對(duì)于煙草自身抗病性機(jī)理的研究，主要集中在抗病基因定位及分子標(biāo)記輔助育種［3］，抗性基因的轉(zhuǎn)化［4－6］和基因組 學(xué)［7－9］等 方 面，而 蛋 白 質(zhì) 組 水 平 上 的研究在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)正式報(bào)道。煙草自身的抗病性與蛋白的表達(dá)與調(diào)控密切相關(guān)，因此從蛋白質(zhì)組學(xué)角度分析煙草與野火病菌互作機(jī)理，揭示煙草的抗病機(jī)制，對(duì)煙草抗病性的合理利用和煙草野火病的可持續(xù)控制具有參考價(jià)值。本研究從蛋白質(zhì)水平入手，研究抗病煙草品種接種野火病菌后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，分析其功能，了解煙草在野火病菌脅迫下哪些蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了變化，為闡明煙草抗野火病的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和克隆重要抗病相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和菌種

抗野火病煙草品種‘K346’和煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）均由牡丹江煙草科學(xué)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料種植、菌種擴(kuò)繁和接種

將煙草種子溫湯浸種后播撒在20cm×60cm育苗盤中，育苗盤中裝滿滅菌的混合營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土與蛭石1∶1混合），待植株長(zhǎng)到5～6片葉時(shí)挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的健康植株移栽至滅菌的混合營(yíng)養(yǎng)土中，在人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃光照16h與25℃黑暗8h交替，光照強(qiáng)度為5 000lx。保持土壤濕潤(rùn)，每隔一周噴施一次煙草葉面肥（由牡丹江煙草科學(xué)研究所提供）。

將活化后的煙草野火病菌在PDA斜面上26℃下培養(yǎng)48h，無(wú)菌水洗下，配成細(xì)菌懸浮液。無(wú)菌水稀釋成濃度為2×108cfu／mL，作為接種液備用。

采用多針針刺法接種［10］。在煙草植株10葉期，選擇距地面第5、6、7片葉接種，每片葉接10個(gè)點(diǎn)，接種后噴水保濕24h。

1.2.2 樣品的采集和蛋白質(zhì)的提取及濃度測(cè)定

分別在接種后0、1、3、6、12、24、36、48h和72h時(shí)取樣，以0h的樣品為空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。取樣部位為接種點(diǎn)附近1cm處未發(fā)病的葉片組織。煙草葉片蛋白質(zhì)的提取方法參照Darwent等的TCA／丙酮法［11］。蛋白濃度測(cè)定參考Bradford法［12］并略作改進(jìn)。

1.2.3 第一向等點(diǎn)聚焦電泳（IEF）和第二向SDSPAGE電泳及染色

參照Ettan 2D系統(tǒng)用戶手冊(cè)與劉文文等［13］的操作方法進(jìn)行。

1.2.4 凝膠圖譜分析、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)分析

利用ImageMasteTM2DPlatinum 6.0軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)譜。以對(duì)照處理為參考膠，使用軟件的自動(dòng)檢測(cè)蛋白質(zhì)點(diǎn)功能和匹配功能，并進(jìn)行手動(dòng)校正等分析后，選取不同處理間相對(duì)體積和強(qiáng)度差異至少大于2.5倍的蛋白點(diǎn)，挖取蛋白點(diǎn)置于0.5mL的EP管中，－80℃保存。將所得的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)送至上海生工蛋白部進(jìn)行酶切和 MALDI－TOF－MS分析，獲得蛋白質(zhì)肽段質(zhì)量數(shù)據(jù)，在http：∥www.matrixscience.com中檢索，找到相匹配的蛋白，得到的信息在http：∥www.ncb.inlm.nih.gov／，http：∥www.expasy.ch／sport／或 http：∥predictome.bu.edu／等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，找到各個(gè)蛋白所對(duì)應(yīng)基因的定位及功能等相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草葉片蛋白質(zhì)等電點(diǎn)范圍的確定

首先采用pH 3～10的IPG膠條對(duì)煙草葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)煙草葉片蛋白質(zhì)在雙向電泳圖譜上分布較集中，大部分位于pH較小的一面。所以選擇pH 4～7的IPG膠條再次進(jìn)行雙向電泳，得到了高清晰、分布好的雙向電泳圖譜，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選用pH 4～7的IPG膠條。

2.2 煙草葉片受野火病菌侵染后的蛋白質(zhì)差異表達(dá)

經(jīng)蛋白質(zhì)凝膠雙向電泳結(jié)合ImageMasteTM2D Platinum 6.0軟件分析，每塊膠上分離得到800～1 000個(gè)蛋白點(diǎn)。對(duì)比對(duì)照樣品的電泳圖譜，比較野火病菌處理的各時(shí)間段處理組與同期對(duì)照組雙向電泳圖譜，在1、3h和6h的處理組上很難找到表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)；而在12、24、36h和48h的雙向電泳圖譜上找到了多個(gè)與對(duì)照組表達(dá)有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)。并且處理12h的電泳圖譜較處理24、36、48h的電泳圖譜重復(fù)性好、表達(dá)量大且相對(duì)穩(wěn)定。經(jīng)軟件分析，共選取處理12h的10個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中，6個(gè)減量表達(dá)，編號(hào)為C15～ C20；4個(gè)增量表達(dá)，編號(hào)為C21～C24（圖1）。

圖1 接菌組與對(duì)照組差異蛋白點(diǎn)表達(dá)圖譜放大圖

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜分析與鑒定

將6個(gè)減量表達(dá)和4個(gè)增量表達(dá)的蛋白點(diǎn)，分別從對(duì)照和接菌處理葉片蛋白質(zhì)2－DE凝膠上挖取下來(lái)，進(jìn)行膠內(nèi)酶切和 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜分析后分別得到10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜，在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與之匹配的蛋白質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)檢索

增量表達(dá)的4個(gè)蛋白質(zhì)分別為葉綠體景天庚酮糖－1，7－二磷酸酯酶、光捕獲葉綠素a／b結(jié)合蛋白、谷氨酰胺合成酶GS58、高等植物光系統(tǒng)II氧復(fù)合物中Psbp A鏈蛋白；減量表達(dá)的6個(gè)蛋白質(zhì)分別為ATP合成酶CF1α亞基、假定1，5－二磷酸核酮糖羧化酶小亞基前體、1，5－二磷酸核酮糖羧化酶鏈S、1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶大亞基、葉綠體ATP合成酶CF1α鏈、核酮糖單－1，5－氫鈣羧／加氧酶大亞基。

3 結(jié)論與討論

本研究以野火病菌侵染后的煙草抗病品種為研究對(duì)象，經(jīng)蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜分析，檢測(cè)到10個(gè)蛋白質(zhì)在接種后表達(dá)量發(fā)生明顯變化，其中4個(gè)為增量表達(dá)，6個(gè)為減量表達(dá)。

3.1 呼吸作用相關(guān)蛋白

本研究分離得到的減量表達(dá)蛋白點(diǎn)C15為ATP合成酶CF1α亞基，C19為ATP合成酶CF1α鏈組成部分。ATP合成酶由F0（葉綠體中稱CF0）和F1（葉綠體中稱CF1）兩部分組成，廣泛存在于線粒體、葉綠體、原核藻、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中，是參與能量代謝的關(guān)鍵酶［14］。葉綠體CF1是酶的膜外部分，由α、β、γ、δ和ε5種亞基組成［15－17］。

寄主－病原物互作原理認(rèn)為，植物的主動(dòng)抗病性在呼吸作用上的表現(xiàn)為：在病原菌侵染初期，植株光呼吸強(qiáng)度和暗呼吸強(qiáng)度明顯降低，顯癥后則明顯上升，產(chǎn)孢期達(dá)到高峰，發(fā)病末期甚至停止呼吸［18］。在本研究中，人工接種12h時(shí)，植株并沒(méi)表現(xiàn)出明顯感病癥狀，此時(shí)為病原菌的侵染初期，作為細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換核心酶的ATPase（C15、C19）減量表達(dá)，表明煙草在被侵染初期電子傳遞和能量傳遞能力減弱，即在病原物侵染初期某些生理途徑被病原菌破壞，或被病原菌產(chǎn)生的降解酶和毒素抑制從而降低植株呼吸作用強(qiáng)度，觸發(fā)植物的主動(dòng)抗病機(jī)制，這一表現(xiàn)與寄主－病原物互作機(jī)制原理相符，是植株主動(dòng)防御機(jī)制起作用的必要過(guò)程。根據(jù)寄主－病原物作用機(jī)制原理，本研究認(rèn)為ATP合成酶相關(guān)酶的減量表達(dá)，是植株抗病過(guò)程中的一個(gè)必要表現(xiàn)。

3.2 能量代謝相關(guān)蛋白

本研究分離到在接種病原菌以后表達(dá)量大幅度下降的4個(gè)差異蛋白點(diǎn)C16、C17、C18和C20，它們均為1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（RuBisCo）相關(guān)蛋白。Rubisco是由多個(gè)大亞基（LSU）和小亞基（SSU）組成的重要蛋白復(fù)合體［19］，大亞基具有催化功能，小亞基僅具有調(diào)節(jié)作用，是決定C3植物光合效率的關(guān)鍵酶，具有同時(shí)參與光合CO2固定及光呼吸 CO2釋放的雙重功能［20］。

很多研究證實(shí)，植株在接種病原菌后rubisco活性和含量均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。如白粉菌侵染大麥［21］和小麥［22］葉片后，rubisco活性和數(shù)量均下降。rubisco是碳素循環(huán)中的重要酶類，其減量表達(dá)預(yù)示著植株體內(nèi)碳素循環(huán)效率的降低和物質(zhì)代謝能力的減弱。本研究中得到的減量表達(dá)蛋白點(diǎn)C16、C17、C18和C20與碳素循環(huán)直接相關(guān)，其表達(dá)量的減少表明煙草在受到病菌侵染后光合作用下降，同時(shí)部分蛋白開(kāi)始降解，植株開(kāi)始逐漸衰弱，進(jìn)一步降低了對(duì)病原菌的抵抗能力，從而加速了植株的發(fā)病。

3.3 糖類和碳代謝相關(guān)蛋白

本研究分離到的蛋白點(diǎn)C21、C23和C24分別為高等植物光系統(tǒng)II氧復(fù)合物中Psbp A鏈蛋白、葉綠體景天庚酮糖－1，7－二磷酸酯酶（sedoheptulose－1，7－biphosphatase，SBPase）和光捕獲葉綠素a／b結(jié)合蛋白，這些蛋白在接種病原菌后表達(dá)量顯著增加。SBPase是碳循環(huán)與糖代謝的關(guān)鍵酶，與1，5－二磷酸核酮糖（ribulose－1，5－biphosphate，RUBP）的再生密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道僅在葉綠體中發(fā)現(xiàn)了該酶，并且SBPase沒(méi)有已知的胞質(zhì)對(duì)應(yīng)物，它的主要作用是將景天庚酮糖－1，7－二磷酸（SBP）去磷酸化，生成景天庚酮糖－7－磷酸和無(wú)機(jī)磷酸。該酶對(duì)SBP具有特異性，并受到其代謝產(chǎn)物甘油酸［23］以及果糖－2，6－二磷酸［24］的抑制［25］。Lefebvre等［26］將擬南芥的SBPase基因轉(zhuǎn)入煙草中并過(guò)量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)光合效率和生長(zhǎng)量以及碳同化水平在轉(zhuǎn)基因植物中明顯增加。駱桂芬等［27］研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖合成量的增加可提高黃瓜抗霜霉病能力，此外，還觀察到光系統(tǒng)II的量子效率降低，導(dǎo)致葉片中的糖類累積量降低。這表明在病原菌侵染的逆境下，葉綠體捕光量增加，提高光反應(yīng)從而補(bǔ)充在呼吸作用減弱情況下未能及時(shí)提供給植物的能量，同時(shí)病植株中糖代謝的主要途徑為磷酸戊糖途徑，會(huì)產(chǎn)生大量的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物是重要的生物合成原料，與核糖核酸、酚類物質(zhì)、木質(zhì)素、植物保護(hù)素等許多化合物的合成有關(guān)，有利于植株修復(fù)被病原菌侵染破壞的植物組織。

3.4 氨基酸代謝相關(guān)蛋白

谷氨酰胺合成酶GS58是植物氮素代謝中的重要酶，其主要功能就是促進(jìn)游離的分子氨合成谷氨酰胺。本研究發(fā)現(xiàn)在接種病原菌后煙草葉片中谷氨酰胺合成酶含量明顯增加，表明煙草植株的氮素循環(huán)增強(qiáng)，更多谷氨酸與游離分子氨在谷氨酸合成酶的作用下生成谷氨酰胺，并參與到植物氨基酸代謝途徑中，這將有利于維持植物體內(nèi)的正常代謝，從而提高植株的抗病性。戚元成［28］、劉衛(wèi)群［29］通過(guò)打頂?shù)姆椒ㄊ篃煵萑~片內(nèi)谷氨酰胺合成酶表達(dá)量增加，發(fā)現(xiàn)煙草氮素代謝的效率得到了顯著的提高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)由于氮素代謝的增加，煙草植株對(duì)逆境的抗性也隨之增加。由此可推測(cè)，谷氨酰胺合成酶在增加煙草抗病性中起重要作用。

綜上所述，在本研究中，接種野火病菌后煙草葉片中物質(zhì)代謝與能量代謝相關(guān)蛋白減量表達(dá)，植株體內(nèi)碳循環(huán)減弱和光合作用能力降低。本研究中檢測(cè)到的減量表達(dá)蛋白點(diǎn)均為直接參與植株光合作用的蛋白，表明植物受病菌侵染后光合作用下降。ATP合成酶的減量表達(dá)表明某些生理途徑被病原菌破壞，或被病原菌產(chǎn)生的降解酶和毒素抑制，從而使植株生理活性降低，進(jìn)一步降低了抗病能力。糖是生物體內(nèi)有機(jī)物代謝中心，糖類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量的增加，表明在病原菌脅迫下葉綠體捕捉并固定了更多光能，并且促進(jìn)了RUBP的再生，加速了碳循環(huán)，從而合成了更多的糖類，提高了煙草的抗病能力。氨基酸代謝相關(guān)蛋白（C22）與植物的抗病性關(guān)系比較復(fù)雜，一方面，由氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)可作為信號(hào)分子刺激植物的自身防護(hù)機(jī)制；另一方面，由于氨基酸循環(huán)的增加，產(chǎn)生更多的氨基酸用于合成各種植物蛋白，能迅速修復(fù)被病原菌破壞的植物自身蛋白，從而提高植物的抗病性。煙草的抗性機(jī)制是十分復(fù)雜的，涉及大量基因的誘導(dǎo)表達(dá)與調(diào)控，這些基因的表達(dá)結(jié)果往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平的變化。本研究得到了煙草對(duì)野火病菌應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中表達(dá)量發(fā)生顯著變化的10個(gè)差異蛋白，但并未對(duì)所得到的差異蛋白在應(yīng)答機(jī)制中的具體作用進(jìn)行闡述，而這些蛋白質(zhì)的具體功能及其在應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中的位置和功能有待進(jìn)一步的深入研究。

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