張榮武 （山東省陵縣畜牧局 253500）

2011年12月，泰安市某蛋雞廠飼養(yǎng)的60日齡的柴公雞發(fā)生大批量死亡。病雞精神沉郁，食欲廢絕，羽毛松亂，翅膀下垂，呼吸困難，噴嚏，有呼吸啰音，鼻腔常有分泌物流出，怕冷扎堆。剖檢發(fā)現(xiàn)病死雞氣囊渾濁，心包渾濁，氣管環(huán)有出血，個(gè)別雞支氣管有干酪樣栓塞，肝臟腫大，腎臟腫大有尿酸鹽沉積，腺胃乳頭腫大個(gè)別雞腺胃乳頭出血，十二指腸有點(diǎn)狀出血，盲腸扁桃體腫大，法氏囊萎縮。該雞場(chǎng)爆發(fā)的疾病疑似腎型傳染性支氣管炎，為進(jìn)一步確診進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂、生化試劑微量管(均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)；ExTaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Trans2K DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；IB、H9、ND病毒抗原購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 細(xì)菌分離及初步鑒定 用無菌接種環(huán)取病死雞的肝臟、心臟，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h，在麥康凱瓊脂平板上挑取紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)平板，革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形狀和染色特性。

1.3 生化反應(yīng)鑒定 將分離菌接種于蔗糖、水楊酸、D-木糖、硫化氫、衛(wèi)矛醇、乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、間-肌醇、尿素酶、七葉苷水解、葡萄糖、山梨醇、吲哚、M-R、V-P、枸櫞酸鹽利用、明膠液化等19項(xiàng)生化試驗(yàn)。

1.4 分子生物學(xué)方法鑒定 根據(jù)GenBank上公布大腸桿菌的序列在其高度保守的區(qū)域分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物用來鑒定大腸桿菌，上游5-atgcgacttgataaatttat-3，下游5-ttagacgacgctggcaatt-3。鑒別擴(kuò)增體系如下：PCR擴(kuò)增體系：10×buffer2.5μl；Mg2＋2μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；模板DNA0.5μl：dNTP0.5μl；雙蒸水18.3μl；ExTaq DNA聚合酶0.2μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10min(94℃變性50s，57℃退火50s72℃延伸1min30s，30個(gè)循環(huán))72℃延伸10min。

1.5 瓊擴(kuò)試驗(yàn) 隨機(jī)抽取該雞群的5只雞無菌條件下從雞的翅靜脈采血2ml左右，靜置血樣。待血液凝固后，分離血清。瓊脂平板的制備:取瓊脂粉和生理鹽水按比例溶解，煮沸至顏色澄明。經(jīng)冷卻后倒入滅菌好的培養(yǎng)皿中，厚度約2mm，靜置冷卻備用。凝固后進(jìn)行打孔，中央1個(gè)，周圍6個(gè)，孔徑3mm，孔距4mm。上方孔為第1孔，按順時(shí)針方向分別稱為2、3、4、5和6孔，中央孔為7孔。將標(biāo)準(zhǔn)抗原放置在瓊脂板的中央孔內(nèi)，將標(biāo)準(zhǔn)血清加入1孔，作對(duì)照，其他孔加待檢血清。37℃溫育12h～24h后觀察結(jié)果。當(dāng)抗原孔與陽性血清孔之間出現(xiàn)沉淀線時(shí)，待檢血清孔與抗原孔之間也出現(xiàn)沉淀線，判為陽性，不出現(xiàn)沉淀線者判為陰性。

1.6 鑒別診斷 用上述提取的血清分別測(cè)該雞群的H9、新城疫抗體效價(jià)。

1.7 藥敏試驗(yàn) 用接種環(huán)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取分離純化的大腸桿菌菌落4～5個(gè)，接種于3～5ml LB液體培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)12h，用生理鹽水稀釋至與0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相同的濃度。在15min內(nèi)，用無菌棉簽蘸取菌液，并在管壁上擠去多余的菌液后均勻涂布于M-H瓊脂平板上，待干。用鑷子蘸取95%乙醇并通過火焰，待燒干后再蘸取乙醇重復(fù)上述操作，共3次。待冷卻后，用此無菌鑷子夾取不同藥敏紙片，按一定間隔貼在平板的不同區(qū)域，即兩紙片間距不小于24mm，紙片距平板邊緣不小于15mm，37℃溫箱培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。用大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌。(本次試驗(yàn)選取藥敏片：阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、丁胺卡那、慶大霉素、安普霉素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磷霉素、恩諾沙星)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上菌落均呈鮮桃紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)。分離菌的菌落在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)分離菌為革蘭氏陰性小桿菌，呈單個(gè)形式存在。通過分離菌在麥康凱與伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，可以初步判斷該細(xì)菌為大腸桿菌。

2.2 分離菌生化鑒定結(jié)果 如表1所示根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》上面關(guān)于大腸桿菌鑒定，可以確定該株細(xì)菌為大腸桿菌。

表1 分離菌生化特性

2.3 分離菌PCR鑒定結(jié)果 根據(jù)GenBank上有關(guān)大腸桿菌高度保守的序列設(shè)計(jì)引物，PCR鑒定結(jié)果如圖1所示分離菌擴(kuò)增得到一條大小為713bp的片段與目的片段大小一致。通過培養(yǎng)特性試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定可以確定分離菌為大腸桿菌。

圖1 大腸桿菌PCR鑒定

2.4 瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果 瓊擴(kuò)結(jié)果顯示1-6孔皆有白色沉淀線產(chǎn)生，說明該5份待檢血清為傳染性支氣管炎陽性血清。

表2 待檢血清抗體效價(jià) (log2)

2.5 鑒別試驗(yàn)結(jié)果 新城疫、禽流感血凝抑制抗體檢測(cè)結(jié)果如表2所示。H9效價(jià)偏低說明該雞群應(yīng)當(dāng)免疫H9，亦可證明無野毒感染。ND抗體效價(jià)低于保護(hù)效價(jià)，該雞群應(yīng)免疫ND疫苗。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知該次試驗(yàn)分離的大腸桿菌對(duì)于阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、安普霉素、恩諾沙星、磷霉素、強(qiáng)力霉素、丁胺卡那耐藥，對(duì)于頭孢曲松、頭孢噻肟中度敏感，環(huán)丙沙星敏感。

表3 藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑 (mm)

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)室診斷該雞群IBV抗體陽性，據(jù)雞場(chǎng)飼養(yǎng)人員描述該雞場(chǎng)沒有注射過傳支疫苗所以該雞場(chǎng)有野毒感染。該雞群中分離并鑒定出大腸桿菌，證明該雞群是爆發(fā)腎型傳染性支氣管炎繼發(fā)大腸桿菌病。測(cè)H9、ND抗體顯示H9、ND抗體偏低沒有達(dá)到保護(hù)效價(jià)，應(yīng)及時(shí)免疫。通過測(cè)抗體說明該雞群沒有感染新城疫、禽流感H9。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該雞群感染的大腸桿菌耐受多種藥物，只有頭孢曲松與頭孢噻肟中度敏感，對(duì)環(huán)丙沙星敏感。治療方案：改善飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，降低雞群密度，飼料或飲水中添加環(huán)丙沙星以防治大腸桿菌繼發(fā)感染。降低飼料中蛋白的含量，并注意補(bǔ)充鈉和鉀?？煽紤]使用家禽基因工程干擾素配合抗菌素、抗病毒藥物、中草藥、電解多維等對(duì)癥治療的綜合防治措施。

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