房 賢 坤, 陳 杰, 姜 吉, 張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.蒙頓茶制品(大連)有限公司, 遼寧 大連 116001 )

0 引 言

茶色素[1]作為一種天然食用色素,是由茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合衍生而來(lái)的一類水溶性色素混合物[2-3],根據(jù)顏色又可分為茶黃素(TFs)、茶紅素(TRs)、茶褐素(TBs)三類[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,茶色素具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基功能[6],在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域存在潛在的開發(fā)價(jià)值。茶色素的研究主要集中在茶黃素和茶紅素上,而茶褐素是一類分子差異極大的化合物,由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,對(duì)茶褐素的研究進(jìn)展緩慢,迄今為止,茶褐素的制備仍停留在過(guò)去單純地從普洱熟茶中提取,不僅含量低,而且由于普洱熟茶價(jià)格昂貴,對(duì)茶褐素的制備和應(yīng)用造成了極大限制。

普洱茶渥堆發(fā)酵是茶褐素形成的關(guān)鍵工序,在微生物分泌的胞外酶的作用下,普洱茶中以茶多酚為主體的多種成分發(fā)生一系列復(fù)雜而劇烈的化學(xué)變化,形成了普洱茶特有的色香味品質(zhì),同時(shí)伴有茶褐素的大量生成[5-6]。作者從普洱茶渥堆發(fā)酵眾多微生物中篩選到一株霉菌fxk-01,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,重點(diǎn)研究了發(fā)酵后普洱生茶中茶褐素的提取條件,測(cè)定了茶褐素樣品的抗氧化能力,以期為茶褐素的實(shí)際生產(chǎn)和利用提供必要的理論參考。

1 試 驗(yàn)

1.1 材料與菌種

普洱生茶,產(chǎn)地云南普洱；霉菌fxk-01,普洱茶渥堆發(fā)酵樣品中篩選得到。

1.2 方 法

1.2.1 種子液的制備

培養(yǎng)基的制備:硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g,氯化鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,硫酸鐵0.01 g,蔗糖30 g,水1 000 mL,將上述各成分依次溶解,待完全溶化后,補(bǔ)足水分到所需體積,將培養(yǎng)基分裝于250 mL燒瓶?jī)?nèi),在121 ℃、0.1 MPa高溫高壓滅菌20 min。

在無(wú)菌條件下,將已滅過(guò)菌的培養(yǎng)基中接入霉菌fxk-01,在28～30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)7 d。

1.2.2 發(fā)酵條件的選擇

分別考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)茶褐素產(chǎn)量的影響。發(fā)酵時(shí)間分別為5、6、7、8、9、10、11 d,發(fā)酵溫度為25、30、35、40、45、50 ℃,發(fā)酵完成后測(cè)其中茶褐素含量[9],確定最適發(fā)酵條件。

1.2.3 提取條件的優(yōu)化

以最優(yōu)發(fā)酵后茶葉為對(duì)象,以茶褐素相對(duì)含量為測(cè)量指標(biāo),對(duì)茶褐素進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取,對(duì)提取過(guò)程中提取次數(shù)、提取溫度、料液比、提取時(shí)間分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),確定最優(yōu)提取條件,提高茶褐素得率。

1.2.4 茶褐素抗氧化活性的測(cè)定

對(duì)制得的茶褐素樣品進(jìn)行清除DPPH自由基能力的測(cè)定[10],確定茶褐素樣品的抗氧化活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適發(fā)酵時(shí)間的選擇

稱取普洱生茶10 g,加去離子水10 mL潤(rùn)濕,經(jīng)100 ℃沸水滅菌30 min,冷卻后在無(wú)菌室接種霉菌fxk-01,在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵,每天搖瓶1次,從第5天開始測(cè)其中茶褐素的含量,確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。結(jié)果如圖1所示,發(fā)酵到第8天后茶褐素含量最大并基本不變,因此最佳發(fā)酵時(shí)間為8 d。

2.2 最適發(fā)酵溫度的選擇

稱取普洱生茶10 g,加去離子水10 mL潤(rùn)濕,經(jīng)100 ℃沸水滅菌30 min,冷卻后在無(wú)菌室接種霉菌fxk-01,分別在25、30、35、40、45、50 ℃培養(yǎng)箱下發(fā)酵8 d,測(cè)定茶褐素質(zhì)量分?jǐn)?shù),確定最優(yōu)發(fā)酵溫度。結(jié)果如圖2所示,35 ℃發(fā)酵條件下能生成最高含量的茶褐素,故最佳發(fā)酵溫度為35 ℃。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵結(jié)果

Fig.1 Result of fermentation on different fermentation time

圖2 不同發(fā)酵溫度的發(fā)酵結(jié)果

Fig.2 Result of fermentation on different fermentation temperature

2.3 發(fā)酵前后茶色素含量的變化

根據(jù)發(fā)酵條件優(yōu)化的結(jié)果,稱取普洱生茶10 g,加10 mL去離子水潤(rùn)濕,經(jīng)100 ℃沸水滅菌30 min后,于無(wú)菌室接種霉菌fxk-01,接種量為5%,在35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)酵8 d后測(cè)茶色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表1,普洱生茶發(fā)酵前后茶紅素和茶黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了73.35%和66.84%,茶褐素含量提高了8.23倍,原因是茶紅素和茶黃素包括其前體茶多酚在微生物分泌的酶的作用下進(jìn)一步氧化縮合生成了茶褐素,造成茶褐素含量大幅升高。

表1 茶葉發(fā)酵前后茶色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

2.4 提取條件的單因素試驗(yàn)

2.4.1 提取次數(shù)的優(yōu)化

選用水為提取溶劑,稱取發(fā)酵后普洱生茶10 g,按料液比1∶10,100 ℃沸水提取20 min,茶湯經(jīng)過(guò)濾、冷卻至室溫后用等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液稀釋80倍,以水做空白,于380 nm處測(cè)OD值,共提取3次。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,普洱生茶在提取2次后茶褐素含量下降明顯,考慮試驗(yàn)原料和后續(xù)的處理工作,合理的提取次數(shù)為2次。

圖3 普洱生茶不同提取次數(shù)提取的結(jié)果

Fig.3 Result of extraction of pu′er tea with different extracting times

2.4.2 提取溫度的優(yōu)化

稱取發(fā)酵后普洱生茶10 g,提取溶劑為水,料液比1∶10,提取時(shí)間20 min,提取2次,僅改變提取溫度,分別為70、80、90、100 ℃。茶湯減壓濃縮干燥后茶粉用100 mL去離子水溶解,等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液1 mL稀釋80倍,以水做空白,在380 nm處測(cè)OD值。結(jié)果如圖4所示,80 ℃以后茶褐素提取率相差不大,因此考慮到生產(chǎn)成本和生產(chǎn)安全,最優(yōu)的提取溫度為80 ℃。

圖4 不同提取溫度的提取結(jié)果

2.4.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

稱取發(fā)酵后普洱生茶10 g,提取溶劑為水,料液比1∶10,提取溫度80 ℃,提取2次,僅改變提取時(shí)間,分別為10、20、30、40 min進(jìn)行試驗(yàn)。茶湯減壓濃縮干燥后茶粉用100 mL去離子水溶解,等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液1 mL稀釋80倍,以水做空白,在380 nm處測(cè)OD值。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,提取時(shí)間從10 min到30 min 時(shí),茶褐素的提取率不斷增大,超過(guò)30 min 繼續(xù)提取,提取率基本不變。故采用提取時(shí)間為30 min。

圖5 不同提取時(shí)間提取的結(jié)果

2.4.4 料液比的優(yōu)化

稱取發(fā)酵后普洱生茶10 g,提取溶劑為水,采用提取溫度80 ℃提取30 min,共提取2次,僅改變料液比,分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40。茶湯經(jīng)減壓濃縮干燥后茶粉用100 mL去離子水溶解,等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液1 mL 稀釋80倍,以水做空白,在380 nm處測(cè)OD值。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,當(dāng)料液比低于1∶30時(shí),隨著料液比的增加,茶褐素的提取率明顯增高,當(dāng)料液比1∶40時(shí)增幅較小。又因?yàn)檫^(guò)高的料液比會(huì)給后續(xù)一些工作如過(guò)濾、濃縮等帶來(lái)麻煩,故最佳的料液比選擇1∶30。

圖6 不同料液比提取的結(jié)果

Fig.6 Result of extraction with different ratio of material and liquid

在最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵普洱生茶,并在最佳提取條件下提取過(guò)濾后獲得茶湯,將茶湯經(jīng)乙酸乙酯萃取2次,每次萃取5 min,除掉茶黃素；取下層用氯仿萃取3次,每次5 min,除去咖啡堿；取水層再用正丁醇萃取2次,每次萃取3 min,除去茶黃素和茶紅素,水層減壓濃縮后烘干至固體,樣品得率約為10%,分光光度法測(cè)得其中茶褐素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為826.4 mg/g。

2.5 提取條件的正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取次數(shù)、溫度、時(shí)間、料液比這4個(gè)因素做四因素三水平正交試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 茶褐素提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Result of orthotropic test about extraction conditions of TBs

因素次數(shù)θ/℃t/min料液比OD值試驗(yàn)111(75)1(25)1(1∶25)0.71試驗(yàn)212(80)2(30)2(1∶30)0.84試驗(yàn)313(85)3(35)3(1∶35)0.82試驗(yàn)421(75)2(30)3(1∶35)0.89試驗(yàn)522(80)3(35)2(1∶30)0.98試驗(yàn)623(85)1(25)1(1∶25)0.91試驗(yàn)731(75)3(35)2(1∶30)0.78試驗(yàn)832(80)1(25)3(1∶35)0.86試驗(yàn)933(85)2(30)1(1∶25)0.88均值10.7900.7930.8270.857均值20.9270.8930.8700.843均值30.8400.8700.8600.857極差0.1370.1000.0430.014

表3 茶褐素提取條件方差分析

Tab.3 Analysis of variance aboat extraction conditions of TBs

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性次數(shù)0.02929.6679.000*溫度0.01625.3339.000時(shí)間0.00321.0009.000料液比0209.000誤差02注:F0.1(2,2)=9.00。

通過(guò)正交方差表分析可以看出,各因素影響的重要性為次數(shù)、溫度、時(shí)間、料液比,且次數(shù)對(duì)結(jié)果影響顯著,溫度和時(shí)間影響不顯著,所以普洱生茶茶褐素的最佳提取條件為:提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間35 min,提取次數(shù)為2次,料液比為1∶30。

2.6 DPPH自由基的清除能力

以VC為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定茶褐素對(duì)DPPH自由基的清除能力,結(jié)果如圖7所示,在所測(cè)濃度范圍內(nèi),相同濃度茶褐素的清除DPPH自由基能力強(qiáng)于VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí),茶褐素提取物清除率達(dá)94.12%,并隨著茶褐素提取物濃度的增加,清除能力增強(qiáng)。由此可見(jiàn),茶褐素提取物對(duì)DPPH自由基有很強(qiáng)的清除能力。

圖7 茶褐素與VC清除DPPH自由基能力的比較

Fig.7 Comparison on DPPH radical scavenging capacity of the extract from TBs and VC

3 結(jié) 論

(1)以普洱生茶為原料進(jìn)行發(fā)酵的最優(yōu)條件為:發(fā)酵溫度35 ℃,發(fā)酵時(shí)間8 d,發(fā)酵完成后茶褐素含量較未發(fā)酵普洱生茶提高了8.23倍。

(2)普洱生茶茶褐素的最佳提取條件為:提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間35 min,提取次數(shù)為2次,料液比為1∶30。

(3)在所測(cè)濃度范圍內(nèi),相同濃度茶褐素提取物的清除DPPH自由基的能力高于VC,且隨著提取物濃度的增加而增強(qiáng),這說(shuō)明茶褐素提取物有很強(qiáng)的抗氧化活性。

[1] 呂虎,孔慶友,冷和平,等. 茶色素制取及化學(xué)組成[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2000, 20(4):63-66.

[2] 程啟坤. 紅茶色素的系統(tǒng)分析方法[J]. 中國(guó)茶葉, 1981(1):24-30.

[3] BAILEY R G, NURSTEN H E, DOWELL I. Isolation and analysis of a polymeric thearubigin fraction from tea[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1992, 59:365-375.

[4] SARKAR A, BHADURI A. Black tea is a powerful chemopreventor of reactive oxygen and nitrogen species: comparison with its individual catechin constituents and green tea[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 284(1):173-178.

[5] 蕭偉祥,鐘瑾,蕭慧,等. 茶色素形成機(jī)理與制取[J]. 茶葉科學(xué), 1997, 17(1):1-8.

[6] 蕭偉祥,鐘瑾,蕭慧,等. 制茶發(fā)酵中茶色素形成生化機(jī)理[J]. 福建茶葉, 1998(3):8-12.

[7] 黃意歡. 茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1995:51-53.

[8] 王會(huì),郭立,謝文磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測(cè)定方法[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(3):92-98.