吳家媛，賈 謙，何文喜，李玉成，況 蓉，倪龍興，牛忠英

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安710032;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義563003;3.北京解放軍第306醫(yī)院，北京100101)

根尖牙乳頭干細(xì)胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)是存在于年輕恒牙根端組織中的具有比牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cell，DPSC)更強(qiáng)的群體倍增能力、端粒酶活性、遷移率及成牙本質(zhì)能力的一類間充質(zhì)干細(xì)胞［1－2］。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有誘導(dǎo)細(xì)胞趨化、促有絲分裂等作用，在MSCs早期分化和發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用［3］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，bFGF在一定的濃度范圍內(nèi)能抑制SCAP的成骨分化，增加細(xì)胞的STRO－1、Nanog、Sox2、Oct4 Rex1的表達(dá)，從而推測(cè)bFGF可維持SCAP的干性(Stemness)［4］。多向分化能力是干細(xì)胞生物特性之一，其能力的強(qiáng)弱在某種程度上提示干細(xì)胞多分化潛能的強(qiáng)弱。bFGF是否在成脂分化中也發(fā)揮著同樣的作用，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。而且關(guān)于bFGF對(duì)MSCs成脂分化的作用，相關(guān)研究結(jié)果也并不一致［5－7］。故本研究以體外培養(yǎng)的SCAP為對(duì)象，初步探討bFGF對(duì)SCAP成脂分化能力的影響，以期明確bFGF是否也能在成脂分化方向上維持SCAP的干性(Stemness)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco，美國(guó));胎牛血清(Hyclone，美國(guó));谷氨酰胺、胰島素、維生素C、DMSO 油紅 O、BrdU(sigma，美國(guó));IBMX、MTT(A-lexis，美國(guó));吲哚美辛(武漢遠(yuǎn)成藥業(yè));相差顯微鏡(Leica DM 6000B)，Mastercycler PCR 儀(Eppendorf，德國(guó));Ps250電泳儀(Savant，美國(guó));BIO－RAD Gel－Doc 2000凝膠成像系統(tǒng);分光光度計(jì)(eppendorf，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 根尖牙乳頭干細(xì)胞(SCAP)的分離、培養(yǎng)及鑒定

收集16～22歲志愿者因正畸需要新鮮拔除的未發(fā)育完全的健康第三磨牙，立即用含雙抗(100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)的 PBS液反復(fù)清洗，分離根尖牙乳頭并剪碎后加入3 mg/mL的Ⅰ型膠原和4 mg/mL Dispase酶，37℃下輕輕震蕩消化1 h，PBS液洗兩遍后接種于6孔培養(yǎng)板，加入含 150 mL/L FBS的 α－MEM 培養(yǎng)基 (含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)，置 50 mL/L二氧化碳孵箱中37℃培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行初步鑒定，并以有限稀釋法篩選克隆化生長(zhǎng)的細(xì)胞，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 bFGF對(duì)SCAP成脂分化能力的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代SCAP以2×104細(xì)胞密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，加入含150 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，棄原液并隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組加入2 mL含bFGF終末濃度為5 ng/mL的成脂誘導(dǎo)液(含100 mL/L FBS、0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌吟、0.5 mol/L氫化可的松、60 mol/L吲哚美辛的α－MEM);對(duì)照組加入相同體積不含bFGF的成脂誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化以及脂肪滴形成情況;油紅O染色，相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 RT－PCR 檢測(cè)脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因 PPAR－γ2

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代SCAP，按1.2.2方法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別在含或不含bFGF(5 ng/mL)的成脂誘導(dǎo)液中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次。分別于培養(yǎng)1周和3周，用RNAiso核酸提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總 RNA;取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照文獻(xiàn)［8］設(shè)計(jì)引物并由北京華大基因公司合成，引物序列分別為PPAR－γ2:5’－CAT TCT GGC CCA CCA ACT T－3’(上游)和 5’－CCT TGC ATC CTT CAC AAG CA－3’(下游);GAPDH:5’－GTC AAG GCC GAG AAT GGG AA－3’(上游)和 5’－GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG－3’(下游)。取 2 μL CDNA 在 20 μL總反應(yīng)體系中進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃30 s，65 ℃延長(zhǎng)1.5 min，循環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上照相并進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SCAP 原代培養(yǎng)

人第三磨牙根尖牙乳頭呈粉紅色，硬度中等，易從根尖孔剝離(圖1a)。酶消化法原代培養(yǎng)3 d即可觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞伸展后呈成纖維細(xì)胞樣，體積較小，胞體豐滿，胞核位于中央，形態(tài)較均一;少數(shù)可見方形、橢圓形和多角形，細(xì)胞呈巢狀或集落狀生長(zhǎng)(圖1b、c)。

2.2 bFGF對(duì)SCAP成脂分化能力的影響

經(jīng)成脂誘導(dǎo)3周后，鏡下可見對(duì)照組的細(xì)胞密度少于實(shí)驗(yàn)組(bFGF組)，細(xì)胞拉長(zhǎng)呈條狀生長(zhǎng)，體積變大，細(xì)胞胞漿內(nèi)及胞外可見圓形折光性脂滴形成;實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞體積小，胞漿立體，細(xì)胞呈梭形，方形或多角形，細(xì)胞線行排列，細(xì)胞有圓形折光性脂滴形成(圖2a、b)。油紅O染色觀察，兩組均可見脂滴形成，其中實(shí)驗(yàn)組脂滴染色面積較多，胞內(nèi)外均可見脂滴形成，且有部分脂滴融合。對(duì)照組細(xì)胞體積較大，雖胞內(nèi)外均有大量脂滴形成，但數(shù)量少于實(shí)驗(yàn)組(圖2c、d)。

圖1 SCAP的原代培養(yǎng)

圖2 成脂誘導(dǎo)3周細(xì)胞形態(tài)及油紅O染色觀察

圖3 RT－PCR檢測(cè)PPAR－γ2 mRNA表達(dá)

2.3 RT－PCR 檢測(cè)PPAR－γ2 mRNA 表達(dá)情況

SCAP成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)1周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(bFGF組)PPAR－γ2 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，但二者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);誘導(dǎo)3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中的PPAR－γ2 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，兩組間灰度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

3 討論

多向分化和自我更新是干細(xì)胞干性的特征性表現(xiàn)，研究表明BMSC向成骨和成脂分化通常維持在一個(gè)平衡水平，一旦成骨分化較多，則成脂分化就會(huì)相應(yīng)減少［9］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－ activated receptor－ γ2，PPAR－γ2)基因是脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志性基因［10］。PPAR－γ2過(guò)表達(dá)時(shí)能促使成纖維細(xì)胞系的成脂轉(zhuǎn)化，而PPAR－γ2缺陷鼠的胚胎干細(xì)胞及胚胎成纖維細(xì)胞則無(wú)成脂分化能力。故通過(guò)檢測(cè)PPAR－γ2的表達(dá)可間接反映細(xì)胞的成脂分化能力。本實(shí)驗(yàn)中在成脂誘導(dǎo)3周后，實(shí)驗(yàn)組SCAP中的脂滴形成數(shù)量多于對(duì)照組，而且細(xì)胞密度相對(duì)較大，細(xì)胞體積小，未見拉長(zhǎng)及變大等現(xiàn)象。RT－PCR檢測(cè)PPAR－γ2基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)1周時(shí)，2組基因表達(dá)無(wú)顯著性差異;3周時(shí)實(shí)驗(yàn)組PPAR－γ2基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組。表明bFGF長(zhǎng)時(shí)間作用于SCAP并進(jìn)行成脂誘導(dǎo)時(shí)能使其維持特異性基因的表達(dá)，提示bFGF具有提高SCAP成脂分化的潛能。

研究報(bào)道，bFGF對(duì)4、6、9代人骨髓MSC成脂誘導(dǎo)無(wú)影響，bFGF組的PPAR－γ2基因表達(dá)直到9代仍保持與未添加bFGF類似的水平［11］。但以上實(shí)驗(yàn)中未對(duì)PPAR－γ2基因的表達(dá)做定量分析，其所得結(jié)論尚有待進(jìn)一步證實(shí)。而Neubauer等［12］在鼠MSC中研究則發(fā)現(xiàn)，bFGF可在鼠MSC分化的各個(gè)階段提高其成脂分化的能力和PPAR－γ2的表達(dá)。周媛等［5］也發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進(jìn)人MSCs向脂肪分化過(guò)程中PPAR－γ2的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在成脂誘導(dǎo)中，添加5 ng/mL bFGF組(實(shí)驗(yàn)組)的細(xì)胞數(shù)量一直在顯著增加，而且細(xì)胞依舊保持類似紡錘型，體積小而立體;而對(duì)照組中的細(xì)胞則有拉長(zhǎng)、變大等現(xiàn)象，推測(cè)可能是由于誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中bFGF作用于SCAP時(shí)能維持其干細(xì)胞基因的表達(dá)，某種程度上抑制了細(xì)胞的老化，進(jìn)而抑制細(xì)胞功能的衰退，故在bFGF存在的情況下對(duì)SCAP進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間成脂誘導(dǎo)時(shí)可促進(jìn)其PPAR－γ2 mRNA的表達(dá)。Colleoni等［13］也提出了相同的觀點(diǎn)，在其研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF可抑制脂肪干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化中發(fā)生衰老和形態(tài)改變，提示細(xì)胞在體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，bFGF可通過(guò)抑制細(xì)胞老化而維持其分化潛能。Amit等［14］發(fā)現(xiàn)，bFGF刺激 hESCs能持續(xù)其增殖，卻不促進(jìn)其分化，但在含有bFGF和血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的hESCs相對(duì)小而密，形態(tài)更典型。

本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)早期bFGF對(duì)SCAP的成脂能力無(wú)影響，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，bFGF可促進(jìn)PPAR－γ2的表達(dá)，提示其具有促進(jìn)SCAP成脂分化的潛能。

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