張躍新,閆寶松,馬鳳,胡偉
(黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 牡丹江157011)
亞側(cè)耳(Hohenbuehelia serotina)[1-2]商品名元蘑,又名凍蘑,是黑龍江省特有的山珍之一。亞側(cè)耳肉質(zhì)細(xì)膩,柔嫩鮮美,營養(yǎng)價(jià)值極高,含有人體所需的多種氨基酸、維生素和微量元素,經(jīng)常食用具有加強(qiáng)肌體免疫,增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力,益智開心,益氣不饑,延年輕身等作用。
RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù),是Williams和Welsh等1990年發(fā)明的一種新型DNA分子標(biāo)記技術(shù),該技術(shù)具有簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和遺傳多樣性的檢測[3]。本文在參考一般食用菌RAPD試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[4-5],建立了亞側(cè)耳 RAPD基本反應(yīng)體系,并對基本反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,為亞側(cè)耳種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 供試菌株
亞側(cè)耳3號,為黑龍江省林副特產(chǎn)研究所培育菌株。
1.1.2 試劑
隨機(jī)引物購自上海生工,基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司,Taq酶及相配套的反應(yīng)緩沖液購自TaKaRa公司。
采用天根生化科技有限公司的“快捷型植物基因組提取試劑盒”進(jìn)行DNA提取。
1.3.1 基本反應(yīng)體系及基本反應(yīng)條件
表1 基本反應(yīng)體系(25μl體系)
基本反應(yīng)程序
1.3.2 各反應(yīng)因素梯度設(shè)計(jì)
表2 各反應(yīng)因素梯度設(shè)計(jì)
將提取的亞側(cè)耳DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。DNA呈現(xiàn)出一條明亮的譜帶且無明顯的拖尾現(xiàn)象,說明所提取的DNA比較完整,質(zhì)量較高,可用于RAPD分析。
經(jīng)引物篩選試驗(yàn),在100個(gè)隨機(jī)引物中篩選出S167、S467、S475、S460四個(gè)引物,其中引物以S167擴(kuò)增效果最好,因此選用S167進(jìn)行RAPD反應(yīng)體系構(gòu)建。在引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)中(圖2)可知,5個(gè)引物濃度梯度中,除1號外,其它梯度擴(kuò)增效果多態(tài)性均非常豐富,且條帶清晰。因此,出于成本考慮,選擇2號為最佳引物濃度,即25μL反應(yīng)體系中添加1.5μL引物。
圖1 亞側(cè)耳DNA電泳結(jié)果
圖2 引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)
模版DNA濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3,其中1號、2號擴(kuò)增條帶不清晰,擴(kuò)增效果不好;3號、4號、5號擴(kuò)增條帶清晰,且呈多態(tài)性,出于成本考慮,選擇3號濃度,即25μL反應(yīng)體系中添加2.0μL模版DNA。
圖3 模版DNA濃度優(yōu)化試驗(yàn)
Taq酶濃度優(yōu)化結(jié)果如圖4,各濃度條帶均比較清晰,且多態(tài)性豐富,其中以2號、3號濃度條件下最為清晰,出于成本考慮,選擇2號濃度,即25μL反應(yīng)體系中添加0.2μL Taq酶。
圖4 Taq酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)
10×PCR Buffer濃度優(yōu)化結(jié)果如圖5,以2號濃度最為清晰,因此25μL反應(yīng)體系中添加2.0μL10×PCR Buffer溶液。
圖5 10×PCR Buffer濃度優(yōu)化試驗(yàn)
圖6 dNTP濃度優(yōu)化試驗(yàn)
dNTP濃度優(yōu)化如圖6,其中1號、2號、3號濃度條件下擴(kuò)增效果均比較清晰,且條帶呈多態(tài)性,其中1號濃度條件下擴(kuò)增效果最為清晰,因此25μL反應(yīng)體系中添加3.0μL dNTP溶液。
在RAPD反應(yīng)中,影響PCR反應(yīng)的因素很多,其中包括PCR緩沖液、dNTP的濃度、循環(huán)參數(shù)(退火溫度、變溫時(shí)間、PCR儀),Taq DNA聚合酶的來源及型號、模板DNA的質(zhì)量和含量、引物純度及濃度、DNA污染的共抽提和擴(kuò)增干擾等。本文對RAPD反應(yīng)體系中的10×PCR Buffer濃度 、dNTP濃度、模板DNA濃度、引物濃度、Taq酶濃度這5個(gè)主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化,最終確立了亞側(cè)耳RAPD-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。反應(yīng)體系(25μL):10×PCR Buffer 2.0μL、2.5mM/L dNTPs3.0μL、5U/μL Taq酶0.20μL、5μM/L引物1.5μL、200ng/μL模板 DNA 2.0μL、去離子水16.30μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,37℃退火30s,72℃延伸2min,40個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,4℃forever。
[1] 戴芳瀾.中國真菌總匯[M].科學(xué)出版社,1979.
[2] Liu Y,Bau Tolgor.A new species of Hohenbuehelia from China[J].Mycotaxon.2009.
[3] 劉明,王繼華.DNA分子標(biāo)記技術(shù).東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,31,(6):65-67.
[4] 李三署,林新堅(jiān).姬松茸和雙胞蘑菇不同菌株的RAPD擴(kuò)增研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2002,9(3):1-4.
[5] 詹才新,朱蘭寶.RAPD技術(shù)在金針菇雜交育種中的應(yīng)用[J].食用菌學(xué)報(bào),1995,2(1):7-11.