殷麗天，黃 幸，李 莉，張 娟，王文娟，楊建一

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030001;2.江西省分宜人民醫(yī)院，新余 336600)

鹽敏感性高血壓大鼠eNOS、iNOS表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系分析

殷麗天1，黃 幸2，李 莉1，張 娟1，王文娟1，楊建一1

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030001;2.江西省分宜人民醫(yī)院，新余 336600)

目的 探討鹽敏感性高血壓形成和心肌細(xì)胞損害產(chǎn)生的機(jī)制。方法 以辣椒辣素?fù)p傷Wistar大鼠感覺神經(jīng)，飼喂高鹽飼料，建立鹽敏感性高血壓大鼠模型。蘇木素—伊紅染色觀察大鼠組織病理學(xué)改變;分光光度法檢測(cè)心肌組織iNOS活性和 NO含量;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)心肌 eNOS、iNOS蛋白表達(dá);RT－PCR檢測(cè)心肌eNOS、iNOS mRNA的表達(dá)。單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組比較體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)。在第2、3、4周時(shí)，辣椒辣素高鹽組鼠尾收縮壓與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。辣椒辣素高鹽組心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞核排列不整齊;心肌iNOS、NO水平升高(P＜0.05);eNOS蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)與eNOS mRNA表達(dá)減少(P＜0.01);iNOS蛋白表達(dá)和iNOSmRNA表達(dá)顯著增高(P＜0.01);凋亡細(xì)胞數(shù)升高(P＜0.05)。結(jié)論 eNOS mRNA和蛋白的低表達(dá)與感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠形成相關(guān)。iNOS mRNA和蛋白的高表達(dá)及iNOS活性升高使心肌組織局部產(chǎn)生大量NO。NO可能使得感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，從而加重心肌的損傷。

鹽敏感性高血壓;辣椒辣素;eNOS;iNOS;細(xì)胞凋亡

在高血壓研究中目前發(fā)現(xiàn)150多個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)分別可從血壓、生理、生化、代謝等途徑參與血壓調(diào)節(jié)［1］。一氧化氮(NO)能促進(jìn)血管平滑肌松弛，導(dǎo)致血管舒張［2］，在高血壓的形成和發(fā)展中具有重要的作用。一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸生成左旋瓜氨酸同時(shí)產(chǎn)生一氧化氮(NO)。本研究擬通過建立感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠模型，觀察心肌內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，分析其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)與心肌中NOS的活性及NO含量之間的關(guān)系，探討 eNOS和iNOS的活性及NO含量在鹽敏性高血壓及靶器官損害發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以及與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

辣椒辣素(CAP)(美國 Sigma公司);NO試劑盒、NOS和考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所);eNOS一抗、iNOS一抗和免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);RNAiso Plus、RTase M－mLV(200 U/μL)、5× M－mLV Buffer、dNTP Mixture(各 2.5 mM)、Taq DNA Polymerase(5 U/μL)、Oligo(dT)18Primer(10 μM)、RNase Inhibitor(40 U/μL)、100 bp DNA Ladder(大連寶生物工程有限公司)。DYY－7C型電泳儀(北京六一儀器廠);JY－SPCT水平電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);BL－410生物信號(hào)顯示與處理系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司);XSL－2熒光顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);YD－202C切片機(jī)(浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠);PCR擴(kuò)增儀(英國，Progene Techne);Neofuge15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司);Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)(天能科技有限公司);UV－2602型紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與建模

雄性Wistar大鼠，初生體重6～7 g，由山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，生產(chǎn)許可證:SCXK(晉)2009－0001，動(dòng)物使用許可證:SYXK(晉)2009－0004。參照 Wang［3］和本室［4］的文獻(xiàn)制備感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠模型。將幼鼠分為2大組:在出生第1天和第2天分別皮下注射辣椒辣素50 mg/kg(溶于含10%乙醇和10%吐溫80的生理鹽水中);對(duì)照組皮下注射同容積的含10%乙醇和10%吐溫80的生理鹽水。哺乳期(3周齡)后，將每組再分為2組，共4個(gè)組(每組7只):①對(duì)照組 +正常(含1%NaCl)飼料;②對(duì)照組 +高鹽(含4%NaCl)飼料;③辣椒辣素 +正常(含1%NaCl)飼料;④辣椒辣素 +高鹽(含4%NaCl)飼料，連續(xù)4周。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

第1、2、3、4周分別稱重和測(cè)量收縮壓。鼠尾袖套法進(jìn)行尾部收縮壓測(cè)量。將大鼠置于40℃環(huán)境溫度條件下，在安靜、清醒狀態(tài)下的進(jìn)行尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)量，取三次測(cè)量的平均值。辣椒辣素+高鹽飼料組鼠尾收縮壓大于150mmHg即可。用20%烏拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。取出心臟，生理鹽水充分灌洗，沿房室溝剪去上部左右心房，緊貼室間隔剪去右室游離壁，余下左心室。心尖部取約100 mg心肌組織，剪取一半約50 mg心肌組織用于單細(xì)胞凝膠電泳［5］，另一半置于凍存管中，液氮保存，行RT－PCR檢測(cè)，另取約100 mg心肌組織用于分光光度法檢測(cè)，其余左心室以10%甲醛固定，預(yù)備行病理學(xué)及免疫組化檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用單因素方差分析檢驗(yàn)其顯著性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化

4周后，各組體重?zé)o顯著性差異(表1)。

表1 各組大鼠體重變化Tab.1 Changes of the body weight of rat in groups

2.2 大鼠鼠尾收縮壓的測(cè)量結(jié)果

各組大鼠鼠尾收縮壓均有明顯增加。在第2、3、4周時(shí)，辣椒辣素高鹽組鼠尾收縮壓與高鹽組相比差異顯著(P＜0.05)。其他組相比尾收縮壓差異不顯著(P＞0.05)。第4周時(shí)，辣椒辣素高鹽組鼠尾收縮壓與其它三組相比血壓顯著升高(表2)。

表2 各組大鼠血壓的變化Tab.2 Changes of the blood pressure of rat in groups

2.3 大鼠心肌TNOS、iNOS以及NO的測(cè)定結(jié)果

辣椒辣素高鹽組大鼠心肌 iNOS水平升高，與對(duì)照組相比差別顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。辣椒辣素高鹽組大鼠心肌NO水平明顯升高，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其余各組與對(duì)照組比較 TNOS、iNOS以及 NO水平?jīng)]有顯著差異(表3)。

表3 各組大鼠心肌TNOS、iNOS以及NO的測(cè)定值Tab.3 Measurement of TNOS，iNOS and NO of rat heart in groups

2.4 大鼠心肌組織病理學(xué)HE染色結(jié)果

對(duì)照組心肌組織表現(xiàn)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核排列整齊，大小均一。辣椒辣素高鹽組心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙明顯增大，肌纖維有斷裂，細(xì)胞核排列不整齊，且大小不一(彩插3圖1)。

2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠心肌 eNOS、iNOS的表達(dá)結(jié)果

光學(xué)顯微鏡觀察，可見各組均有eNOS蛋白表達(dá)(棕黃色陽性細(xì)胞)(彩插3圖2)，采用 Imagepro－Plus圖象分析軟件對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行計(jì)量分析，計(jì)算每個(gè)視野陽性染色的累積光密度值(integrated optical density，IOD)，對(duì)免疫組化進(jìn)行定量分析，計(jì)算心肌組織中eNOS蛋白表達(dá)量。在心肌組織中，辣椒辣素高鹽組eNOS蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。光學(xué)顯微鏡觀察，可見各組均有iNOS蛋白表達(dá)，對(duì)免疫組化進(jìn)行定量分析，計(jì)算心肌組織中iNOS蛋白表達(dá)量。在心肌組織中，辣椒辣素高鹽組iNOS蛋白表達(dá)顯著增高，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，辣椒辣素、高鹽組 iNOS蛋白表達(dá)與CON－NS組比較無顯著差別(表4)。

表4 各組大鼠心肌eNOS與iNOS蛋白表達(dá)IOD值分析Tab.4 the IOD analysis of eNOS and iNOS protein expression of rat in heart

2.6 大鼠心肌iNOS、eNOS mRNA表達(dá)

RT－PCR分析心肌組織 iNOS、eNOS mRNA 表達(dá)，iNOS、eNOS、β－actin 分別在 395bp、470bp 和240 bp區(qū)域有清晰明亮的條帶(圖3－5)，證明iNOS、eNOS mRNA表達(dá)。采用凝膠成像系統(tǒng)半定量分析，辣椒辣素高鹽組iNOSmRNA表達(dá)增高，和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，辣椒辣素、高鹽組iNOSmRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無顯著差別。辣椒辣素高鹽組大鼠心肌組織eNOS mRNA表達(dá)減少，和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，辣椒辣素、高鹽組 eNOS mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無顯著差別(表5)。

圖3 心肌β－actin表達(dá)電泳圖Fig.3 β－actin expression in heart

圖4 心肌iNOS mRNA表達(dá)電泳結(jié)果Fig.4 iNOS mRNA expression in heart

圖5 心肌eNOS mRNA表達(dá)電泳結(jié)果Fig.5 eNOS mRNA expression in heart

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞eNOS與iNOS mRNA表達(dá)Tab.5 The eNOS and iNOS mRNA expression of rat in heart

2.7 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率

熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞，可見凋亡細(xì)胞呈頭小尾大型，每組動(dòng)物觀察50個(gè)細(xì)胞。在心肌組織中，辣椒辣素高鹽組凋亡細(xì)胞數(shù)增高(P＜0.05)(表6)。

表6 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率Tab.6 Rate of apoptosis of ratin heart cel

3 討論

鹽敏感者在血壓正常人群中的檢出率為15%～42%，在高血壓人群中，鹽敏感性高血壓則高達(dá)28%～74%［6］。鹽敏感性高血壓患者表現(xiàn)出心、腦、腎等重要靶器官損害以及一系列涉及血壓調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌及生化代謝異常。

給新生大鼠適量的辣椒辣素可選擇性和永久性地破壞90%以上的外周無鞘傳入神經(jīng)。引起感覺神經(jīng)受損會(huì)使抑制性降低，導(dǎo)致對(duì)鹽的敏感性增加，引起鈉水排泄的減少引起鹽敏感性高血壓［7］。本實(shí)驗(yàn)辣椒辣素高鹽組鼠尾收縮壓都達(dá)到了150mmHg以上，符合實(shí)驗(yàn)的需求，同時(shí)也表明辣椒辣素處理新生Wistar大鼠后給予高鹽飼料能獲得較穩(wěn)定的高血壓模型。

eNOS廣泛分布于心臟、腎臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)基礎(chǔ)NO的合成，調(diào)節(jié)各種生理功能。何燕［8］等在自發(fā)性高血壓大鼠中證明了eNOS可以從基因和蛋白水平對(duì)血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)。汪培華［9］等通過雄性Sprague－Dawley大鼠實(shí)驗(yàn)說明 eNOS基因的導(dǎo)入有助于血壓的降低。因此，我們也可以推斷eNOS基因的缺失或表達(dá)量的改變可以使血壓升高。本研究證明辣椒辣素高鹽組大鼠心肌組織eNOS mRNA和蛋白表達(dá)減少，表明大鼠 eNOS mRNA和蛋白表達(dá)減少參與鹽敏感性高血壓的形成。

譚敦勇等［10］運(yùn)用腎動(dòng)脈不全結(jié)扎方法制備 SD大鼠腎血管性高血壓模型，研究結(jié)果表明在腎血管性高血壓情況下，iNOS具有重要的代償調(diào)節(jié)作用，血壓升高是刺激iNOS表達(dá)及活性的重要因素。高琳琳等［11］的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)研究結(jié)果提示NO生成增加與血壓降低密切相關(guān)，當(dāng)血壓變化的時(shí)候iNOS的活性也發(fā)生變化。然而以上研究沒有對(duì)血壓變化時(shí)iNOS的蛋白、mRNA表達(dá)及活性的變化情況和NO含量的變化是否與iNOS的變化相關(guān)，以及它們之間的相互作用在高血壓時(shí)引起的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析。本研究結(jié)果表明鹽敏感性高血壓大鼠在產(chǎn)生高血壓后心肌組織iNOS出現(xiàn)mRNA、蛋白表達(dá)量及活性顯著升高，同時(shí)NO含量水平也升高。

單細(xì)胞凝膠電泳方法(彗星試驗(yàn))是近些年發(fā)展起來的在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA斷裂的方法，實(shí)驗(yàn)證明可檢測(cè)含有大量DNA碎片的凋亡細(xì)胞［12，13］。本實(shí)驗(yàn)采用單細(xì)胞凝膠電泳方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)在心肌組織中，辣椒辣素高鹽組凋亡細(xì)胞數(shù)增高(P＜0.05)。心肌細(xì)胞凋亡是高血壓病發(fā)生與發(fā)展的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［14］，Hamet等［15］應(yīng)用末端酶標(biāo)記法(TUNEL)及DNA凝膠電泳技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌細(xì)胞凋亡的證據(jù)。江立生［16］研究表明 SHR心肌肥大過程中心肌細(xì)胞存在凋亡與增殖失衡，凋亡是心臟肥大形成的主要原因和機(jī)制之一。

本研究結(jié)果表明，eNOS mRNA和蛋白表達(dá)量的減少可以導(dǎo)致高血壓的形成，高血壓形成過程中或形成前存在心肌組織的iNOSmRNA和蛋白表達(dá)量升高，從而使iNOS表達(dá)量及活性升高導(dǎo)致局部大量NO生成，大量NO在局部作用可能是使心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的原因之一，當(dāng)然，其它的凋亡相關(guān)基因也可能參與心肌細(xì)胞的凋亡過程。關(guān)于高血壓情況下，iNOS引起局部大量 NO生成的機(jī)制，可能是由于iNOS酶蛋白本身的變化，如蛋白變構(gòu)或化學(xué)修飾等導(dǎo)致酶活性升高從而產(chǎn)生更多NO之外，亦可能包括iNOS蛋白的穩(wěn)定性增加以及由iNOS mRNA到 iNOS蛋白的翻譯過程的易化等，致使iNOS酶蛋白分子的增加，這些作用機(jī)制還需要做進(jìn)一步研究。

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Studies on the Expression of eNOS，iNOS and Heart Apoptosis in Salt-Sensitive Hypertensive Rat

YIN Li－tian1，HUANG Xing2，LI Li1，ZHANG Juan1，WANG Wen－juan1，YANG Jian－yi1
(1.College of Basic Medicine，Shanxi Medical University，Taiyuan，030001，China;2.The Hospital of Fenyi，Xinyu，336600，China)

Objective To propose the formation of salt－sensitive hypertension and heart cell damage.Methods Wistar rats，capsaicin was injected and high salt diet was feeded，the model of salt－sensitive hypertension was established.the change of heart histopathology were observed，spectrophotometry to detect heart iNOS activity and NO content;immunohistochemistry was performed to detect the expression of eNOS and iNOS protein in heart，the expression of eNOS and iNOS mRNA in heart was determined by RT－PCR， the level of apoptosis was assessed by single cell gel electrophoresis.Results The rats body weight was not significant difference among groups at the end of the experiment(P＞ 0.05).The capsaicin－h(huán)igh salt diet group systolic blood pressure was significantly higher than the other three groups(P＜0.05)in 2，3，4 weeks.Capsaicin－h(huán)igh salt diet group cardiac muscle cell hypertrophy，muscle fiber disarrangement，nuclei arranged in irregular.The activity of iNOS and level of NO in capsaicin－h(huán)igh salt diet group significantly were higherwhen compared with control group.eNOS protein and eNOS mRNA significantly decreased compared with control group(P＜ 0.01)iNOS protein and iNOS mRNA of capsaicin－h(huán)igh salt diet group were significantly increased compared with control group(P ＜0.01)in heart.The number of apoptotic cells of capsaicin－h(huán)igh salt diet group significantly increased compared with control group(P＜0.05).Conclusions The decreased express of eNOS mRNA and protein was related with the forming of salt－sensitive hypertension.The increased express of iNOS mRNA and protein could produce a large number of NO in heart.NO may make the cell apoptosis increasing and the damage of heart in salt－sensitive hypertensive rats.

Salt－sensitive hypertension;eNOS;iNOS;Cell apoptosis

R332

A

1671－7856(2012)09－0041－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.009

2012－08－25

圖1 各組大鼠心肌組織圖（HE染色）400×
Fig.1 Heart tissue for each rat group（HE staining） 400×

A：CON-NS組；B：CON-HS組；C：CAP-NS組；D：CAP-HS組

圖2 各組大鼠心肌組織eNOS蛋白表達(dá)400×
Fig.2 eNOS protein expression of rat in heart 400×

A：CON-NS組；B：CON-HS組；C：CAP-NS組；D：CAP-HS組

山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(200811076－1)。

殷麗天(1982－)，女，講師，從事分子生物學(xué)研究。E－mail:tianliyin@yahoo.com.cn。

楊建一，教授，從事醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究。E－mail:jianyiyang@163.com。