雷 靜，李和生，張麗媛，孫楠楠

寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，寧波 315211

烏賊皮膠原蛋白的提取及結(jié)構(gòu)表征

雷 靜，李和生*，張麗媛，孫楠楠

寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，寧波 315211

為了充分利用烏賊加工廢棄物，分析了烏賊皮的基本組成成分，優(yōu)化了從烏賊皮中提取膠原蛋白的工藝條件，并利用SDS-PAGE垂直電泳、紫外掃描和傅里葉變換紅外光譜對(duì)所提取的膠原蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，烏賊皮中含有大量膠原蛋白，可作為膠原蛋白來(lái)源的補(bǔ)充。采用酸酶復(fù)合提取膠原蛋白的最佳條件為:酒石酸濃度為0.1 mol/L，胃蛋白酶添加量為1400 U/g，料液比為1∶20(m∶V，原料)，4℃提取18 h，提取率為12.08%。SDS-PAGE垂直電泳、紫外掃描和傅里葉變換紅外光譜的結(jié)果表明，采用酸酶復(fù)合法從烏賊皮中提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，保持了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

膠原蛋白;烏賊皮;提取;結(jié)構(gòu)表征

烏賊(Cuttlefish)又名墨魚、花枝，具有較高營(yíng)養(yǎng)和多種藥用功能，其肉、蛋、脊骨(中藥名為海螵蛸)均可進(jìn)藥。最常見的種類有金烏賊、曼氏無(wú)針烏賊等，是我國(guó)四大海產(chǎn)之一，廣泛分布在我國(guó)各海區(qū)。烏賊加工會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料，如烏賊皮、側(cè)鰭、內(nèi)臟、內(nèi)骨骼等，如果不進(jìn)行有效處理，不僅會(huì)造成環(huán)境的污染，而且會(huì)浪費(fèi)大量的寶貴資源。有研究表明，占烏賊廢棄物總量8% ～13%的烏賊皮中含有豐富的蛋白質(zhì)資源，蛋白質(zhì)含量約占烏賊皮干重的80%以上，主要是膠原蛋白［1］。膠原蛋白是一種天然高分子化合物，具有一定的凝膠強(qiáng)度、乳化性、吸水性和保濕性等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)中。膠原蛋白的提取方法一般有熱水法、酸法、堿法、酶法等，其中酶法提取具有高效性、溫和性，因而廣泛用于食品加工中［2］。為了有效地利用資源，本研究以烏賊加工過(guò)程中產(chǎn)生的烏賊皮為原料，采用酸酶復(fù)合法提取膠原蛋白，考察酸濃度、加酶量、料液比及提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響，優(yōu)化提取的工藝條件，并對(duì)所提取的膠原蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏賊，品種為金烏賊(Sepia esculenta)，購(gòu)買于寧波市莊市市場(chǎng)。將皮剝下后用自來(lái)水清洗數(shù)次，然后用剪刀將烏賊皮剪碎，再用自來(lái)水清洗干凈，室溫下晾干后儲(chǔ)存在-20℃條件下備用。

胃蛋白酶(比活力1∶3000)南寧龐博生物有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris堿、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán) R-250、溴酚藍(lán) 上海捷瑞生物工程有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新銳-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;H1650高速臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;79480真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司;DYCZ-24D型電泳槽，DYY-6B型電泳儀，北京市六一儀器廠;Tanon-410型凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司;紫外-可見光譜儀，美國(guó)Varian公司;Tensor 27傅立葉紅外光譜儀，德國(guó)布魯克光譜儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 烏賊皮基本成分測(cè)定

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009系列(2003年版)，水分測(cè)定采用直接干燥法;灰分測(cè)定采用灰化法;粗蛋白測(cè)定采用微量凱氏定氮法;粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法;總糖測(cè)定采用苯酚硫酸法。

1.3.2 前處理［3］

以下操作過(guò)程均在4℃下進(jìn)行。稱取20 g碎烏賊皮，加4倍質(zhì)量的水組織搗碎，用料液比為1∶30 (魚皮原重:鹽溶液體積)的0.1 mol/L NaCl溶液，浸泡3 h，離心，取沉淀用相同溶液重復(fù)操作一次。除雜后樣品，按照原皮重量，以1∶20的料液比加入0.01 M NaOH溶液(含1%H2O2)，浸泡12 h，水洗至中性后離心。取沉淀加冰水至200 g，間歇?jiǎng)驖{，制成10%勻漿液備用。

1.3.3 膠原蛋白的提?。?-6］

選擇酸加胃蛋白酶復(fù)合提取膠原蛋白。實(shí)驗(yàn)均在4℃進(jìn)行。

準(zhǔn)確稱取10 g烏賊皮勻漿液，按設(shè)定的提取條件(酸濃度、料液比、加酶量、提取時(shí)間)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，離心分離后得上清液，測(cè)定上清液中膠原蛋白含量和雜蛋白含量。提取液中膠原蛋白含量越大，提取率越高;雜蛋白含量越小，溶出率越低，提取純度越高。提取后的膠原蛋白溶液，加氯化鈉-酒石酸溶液使最終鹽濃度為0.9 mol/L，攪拌5 min后4℃靜置過(guò)夜。鹽析后離心，沉淀用0.1 mol/L酒石酸溶解后移入透析袋，用pH 7.2的磷酸緩沖液透析1 d，再用蒸餾水透析2 d，每天更換透析液3～4次。冷凍干燥后備用。

1.3.4 測(cè)定方法

1.3.4.1 膠原蛋白的測(cè)定

羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量，再乘以換算系數(shù)，即可得到膠原蛋白的含量。采用氯胺T法［7］測(cè)定羥脯氨酸。

式中:c1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對(duì)應(yīng)的羥脯氨酸的含量(μg/mL);n為稀釋倍數(shù);11.1為換算系數(shù);w1為提取液的膠原蛋白含量(mg/mL);v提為提取液的總體積(mL);m為烏賊皮質(zhì)量(g)。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

膠原提取液中雜蛋白含量的測(cè)定，采用考馬斯亮藍(lán)法，按下式計(jì)算:

式中:c2為標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(μg/mL);n為稀釋倍數(shù);w2為膠原提取液中雜蛋白含量(mg/mL);v提為提取液的總體積(mL);m為烏賊皮質(zhì)量(g)。

1.3.5 烏賊皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)表征［8］

1.3.5.1 SDS-PAGE電泳分析

1.3.5.2 紫外吸收光譜分析

將凍干的膠原蛋白樣品溶于0.1 mol/L酒石酸溶液中，配成1 mg/mL膠原溶液，在190～400 nm的近紫外區(qū)進(jìn)行掃描。

1.3.5.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

微量膠原樣品經(jīng)KBr壓片后，用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏賊皮基本組成分析

從表1中可看出，烏賊皮含有大量水分，干物質(zhì)占20.38%。粗蛋白含量為16.65%，約占烏賊皮干重的81%。羥脯氨酸的含量為1.17%，而魚類膠原的平均換算系數(shù)為11.1［9］，經(jīng)估算得膠原含量約為13%，約占烏賊皮蛋白質(zhì)總量的78%，因此，從烏賊皮中提取膠原蛋白具有可行性。

表1 烏賊皮基本成分Table 1 The basic composition of cuttlefish skin

2.2 烏賊皮膠原蛋白提取條件優(yōu)化

2.2.1 酸種類的選擇

產(chǎn)業(yè)扶貧是我國(guó)長(zhǎng)期扶貧開發(fā)實(shí)踐中逐步形成的專項(xiàng)扶貧開發(fā)模式之一，是打贏脫貧攻堅(jiān)戰(zhàn)的一項(xiàng)利器。然而，總結(jié)各地產(chǎn)業(yè)扶貧實(shí)踐，也存在一些共性問(wèn)題。我們要基于問(wèn)題導(dǎo)向，更好處理三種關(guān)系，以發(fā)揮產(chǎn)業(yè)扶貧的更大效力。

分別用醋酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸在相同條件下提取(空白pH為2)，酸濃度均為1.0 mol/ L，加酶量均為1400 U/g(酶/底物)，料液比為1∶10 (W∶V=原皮重量∶酸溶液)，酸酶同時(shí)作用，4℃提取12 h。五種酸作為介質(zhì)與胃蛋白酶共同作用提取烏賊皮中膠原蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。其中，酒石酸與胃蛋白酶共同作用效果最好，提取液膠原蛋白含量最高，膠原提取率為7.92%。因此選擇酒石酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同酸對(duì)膠原蛋白提取的影響Fig.1 Effect of different acid on the extraction of collagen

2.2.2 酸濃度的確定

稱取等量前處理后的烏賊皮勻漿液，按照烏賊皮原重計(jì)算，加酶量為1400 U/g(酶/底物)，料液比為1∶10(W∶V)，酒石酸溶液濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 mol/L，4℃提取18 h。按此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 酸濃度對(duì)膠原蛋白提取的影響Fig.2 Effect of acid concentration on the extraction of collagen

由圖2可見，酸濃度為0.5 mol/L時(shí)，膠原蛋白提取率最高，此后隨著酸濃度的增加，膠原蛋白提取率降低;可能是因?yàn)榧尤?.5 mol/L酒石酸后，提取液的pH最適宜胃蛋白酶作用。隨著酸濃度的增加，雜蛋白溶出率不斷升高，說(shuō)明溶出了更多非膠原蛋白。綜合考慮膠原蛋白的得率和純度，選擇0.5 mol/L酒石酸為最適酸濃度。

2.2.3 料液比的確定

稱取等量前處理后的烏賊皮勻漿液，按照烏賊皮原重計(jì)算，加酶量為1400 U/g(酶/底物)，酒石酸溶液濃度為1.0 mol/L，料液比(W∶V)分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50，4℃提取18 h。按此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)膠原蛋白提取的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on the extraction of collagen

由圖3可見，料液比為1∶20(W∶V)時(shí)，膠原蛋白提取率最高，此后隨著料液比(W∶V)的減小，提取率降低;可能是因?yàn)榧尤脒^(guò)多的酸溶液后稀釋了反應(yīng)液，反而降低了酶的作用。同時(shí)，料液比為1∶20時(shí)，雜蛋白溶出率也最小，隨著料液比(W∶V)的減小提取液中雜蛋白含量略有增加。綜合考慮膠原蛋白的得率和純度，選擇1∶20(W∶V)為最適料液比。

2.2.4 加酶量的確定

稱取等量前處理后的烏賊皮勻漿液，按照烏賊皮原重計(jì)算，料液比為1∶10(W∶V)，酒石酸溶液濃度為0.5 mol/L，加酶量分別為700、1400、2100、3500、4200、5600 U/g(酶/底物)，4℃提取18 h。按此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 加酶量對(duì)膠原蛋白提取的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the extraction of collagen

由圖4可見，加酶量為2100 U/g時(shí)，膠原蛋白提取率最高，此后隨著加酶量的增加，提取率基本保持不變;可能是因?yàn)榱弦罕扰c加酶量的相互作用，當(dāng)加酶量大于2100 U/g時(shí)，酶濃度已趨于飽和，使得部分胃蛋白酶無(wú)法充分作用。同時(shí)，隨著加酶量的增加，雜蛋白溶出率相應(yīng)減小，可能是部分胃蛋白酶作用于非膠原蛋白，降低了提取液中非膠原蛋白含量。綜合考慮膠原蛋白的得率和純度，選擇2100 U/g為最適加酶量。

2.2.5 提取時(shí)間的確定

稱取等量前處理后的烏賊皮勻漿液，按照烏賊皮原重計(jì)算，加酶量為1400 U/g(酶/底物)，料液比為1∶10(W∶V)，酸濃度為0.5 mol/L，4℃提取，提取時(shí)間分別為6、12、18、24、36和48 h。按此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取的影響Fig.5 Effect of time on the extraction of collagen

由圖5可見，提取時(shí)間小于18 h，膠原蛋白提取率隨提取時(shí)間的增加而顯著升高;提取時(shí)間大于18 h，隨提取時(shí)間的增加，膠原蛋白提取率略有降低，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，部分未鈍化的內(nèi)源酶對(duì)膠原蛋白發(fā)生了作用。當(dāng)提取18 h后，酶與底物反應(yīng)最充分，提取液中膠原蛋白含量最高，提取率最大;此時(shí)，膠原提取液中雜蛋白含量也最高。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雜蛋白溶出率逐漸降低，可能是部分胃蛋白酶作用于非膠原蛋白。綜合考慮膠原蛋白的得率和純度，選擇18 h為最適提取時(shí)間。

2.2.6 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酸濃度、加酶量、料液比和提取時(shí)間四個(gè)因素，每個(gè)因素確定3個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

實(shí)驗(yàn)均在4℃進(jìn)行，離心后得上清液，測(cè)定上清液中膠原蛋白含量，計(jì)算提取率。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results and range analysis of orthogonal test

由表3可知，實(shí)驗(yàn)極差因素C＞D ＞B＞A，說(shuō)明影響提取因素排列依次為料液比 ＞提取時(shí)間 ＞加酶量 ＞酸濃度，根據(jù)K值，得出理論上最佳提取工藝條件為A1B2C3D3。所以，利用酒石酸-胃蛋白酶從烏賊皮提取膠原蛋白的較佳工藝為A1B2C3D3，即酒石酸溶液濃度為0.1 mol/L，加酶量為1400 U/g，料液比為1∶20，提取時(shí)間為18 h。重復(fù)最佳條件試驗(yàn)，獲膠原蛋白提取率為12.08%。

2.3 烏賊皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 SDS-PAGE電泳分析

取凍干的膠原蛋白樣品進(jìn)行電泳分析，見圖6。

圖6 烏賊皮膠原蛋白的電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of collagens from cuttlefish skin

如圖6所示，烏賊皮膠原蛋白的電泳圖譜由三條鏈組成，即α1(α2)、β以及少量的γ，α1、α2鏈的分子量在110-130 KD之間，β、γ鏈的分子量在200 KD以上，與其他來(lái)源膠原蛋白［6，10-12］的電泳譜帶基本一致。與標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原［13］比較，符合典型的Ⅰ型膠原蛋白的特征，表明提取出來(lái)的膠原蛋白主要是Ⅰ型膠原蛋白。圖譜上無(wú)其他雜帶，可見所提膠原蛋白純度較高，達(dá)到了電泳純。

2.3.2 紫外光譜分析

配制膠原蛋白溶液，進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，烏賊皮膠原蛋白在234 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈吸收，這與其他來(lái)源的膠原蛋白［6，8-9］的紫外吸收峰基本相似，與標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ型膠原蛋白［14］比較，認(rèn)為符合Ⅰ型膠原的特征紫外吸收。膠原蛋白紫外吸收的另一個(gè)特征是在250～290 nm之間幾乎無(wú)吸收峰，因?yàn)樯彼?、酪氨酸和苯丙氨酸中的R基團(tuán)含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，分別在283、278和259 nm處有吸收峰，其中以色氨酸在280 nm處吸收最強(qiáng)烈;而膠原蛋白不含色氨酸，酪氨酸含量較少。烏賊皮膠原蛋白在這個(gè)區(qū)域的紫外吸收較弱，與此特征符合。

圖7 烏賊皮膠原蛋白的紅外圖譜Fig.7 Fourier transform infrared spectrum of collagens from cuttlefish skin

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

取凍干的膠原蛋白樣品進(jìn)行紅外光譜分析，見圖7。

圖7顯示了烏賊皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜圖，其中3424 cm-1處的強(qiáng)吸收是膠原蛋白酰胺A的N-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，2928 cm-1處的弱吸收是膠原蛋白酰胺B的C-N伸縮振動(dòng)的特征吸收峰。酰胺Ⅰ帶的特征吸收頻率為1600-1700 cm-1，是由蛋白多肽骨架的C=O伸縮振動(dòng)引起的;烏賊皮膠原蛋白的酰胺Ⅰ帶位于1655 cm-1處，符合酰胺Ⅰ帶的出峰位置。膠原蛋白的酰胺Ⅱ帶出現(xiàn)在1454 cm-1處，它是由C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)共同引起的。由于膠原蛋白的甘氨酸和特征氨基酸羥脯氨酸、脯氨酸含量高，且形成獨(dú)特的(Gly-Pro-Hyp)n序列，所以在1200～1400 cm-1光譜范圍內(nèi)，膠原蛋白具有特別的紅外光譜特征。1200～1360 cm-1譜帶屬于酰胺Ⅲ，是由C-N伸縮和N-N彎曲引起的，歸屬于Gly骨架和Pro側(cè)鏈的CH2搖擺振動(dòng)峰也在此區(qū)域;烏賊皮膠原蛋白的酰胺Ⅲ帶位于1241 cm-1處。

由于烏賊皮膠原蛋白的 FT-IR圖譜中，出現(xiàn)1655、1241和1454 cm-1三個(gè)明顯的吸收峰，分別位于酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ帶和酰胺Ⅱ帶的出峰位置，與文獻(xiàn)中報(bào)道的鯉魚魚皮膠原蛋白［12］、狹鱈魚皮膠原蛋白［15］、深海鮭魚膠原蛋白［16］、尼羅河鱸魚皮膠原蛋白［17］進(jìn)行了比較，同時(shí)結(jié)合電泳圖譜分析，表明烏賊皮膠原蛋白具有特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定烏賊皮膠原蛋白的基本組成，可知烏賊皮中粗蛋白含量為16.65%(濕重計(jì))，約占干重的81%，其中膠原含量占烏賊皮蛋白質(zhì)總量的78.13%。因此，從烏賊皮中提取膠原蛋白具有可行性。研究了從烏賊皮中提取膠原蛋白的工藝條件，結(jié)果表明，采用酸酶復(fù)合提取膠原蛋白的最佳條件為:酒石酸濃度為0.1 mol/L，胃蛋白酶添加量為1400 U/ g，料液比為1∶20，4℃提取18 h，膠原蛋白提取率為12.08%。同時(shí)對(duì)所提取的膠原蛋白進(jìn)行了電泳圖譜、紫外和紅外光譜分析，結(jié)果表明所提取的烏賊皮膠原蛋白純度較高，主要是Ⅰ型膠原，并具有特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)特征。

1 Hao ZL(郝振林)，Zhang XM(張秀梅)，Zhang PD(張沛東).Biological characteristics and multiplication techniques ofSepia esculenta.Chin J Ecology(生態(tài)學(xué)雜志)，2007，26: 601-606.

2 Jiang DT(蔣挺大)，Zhang CP(張春萍).The Collagen(膠原蛋白).Beijing:Chemical Industry Press，2001，1-60.

3 Zhang JZ(張建忠).Research on preparation and characterization of collagen from skin ofgrass carp.Nanjing:Nanjing Agricultural University(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))，PhD.2007.

4 Takeshi N，Eiji Y，Kei T，et al.Isolation and characterisation of collagen from the outer skin waste material ofcuttlefish(Sepia lycidas).Food Chem，2001，72:425-429.

5 Mario Hiram UM，Joe Luis AM，Maribel PJ，et al.Jumbo squid(Dosidicus gigas)mantle collagen:Extraction，characterization，and potential application in the preparation of chitosan-collagen biofilms.Bioresour Technol，2010，101:4212-4219.

6 Zhang JZ(張建忠)，An XX(安辛欣)，Wang L(王林)et al.Isolation and Characterization of Acid-soluble and Pepsinsoluble Collagens from Skin ofGrass Carp(Ctenopharyngodon idellus).Food Sci(食品科學(xué))，2006，12:556-558.

7 Yan MY(閆鳴艷).Study on the structure and physical properties of collagen fromwalleye pollock(Theragra chalcogramma)skin.Qingdao:Ocean University of China(中國(guó)海洋大學(xué))，PhD，2009.

8 Zhao YH(趙玉紅)，Gao T(高天).Characteristics of Collagen from Deer Bone.Food Sci(食品科學(xué))，2008，7:43-47.

9 Zhong ZH(鐘朝輝)，Li CM(李春美)，Gu HF(顧海峰)etal.Extraction and Basic Properties of Pepsin-soluble Collagen fromGrass Carp(Ctenopharyndogon idellus)Scales.Fisheries Sci(水產(chǎn)科學(xué))，2007，2:91-95.

10 Yi JB(易繼兵)，Li BF(李八方)，Zhao X(趙雪).Extraction and the physical and chemical characterization of collagen insnailfish.Sci Tech Food Ind(食品工業(yè)科技)，2010，3:65-69.

11 Yang XQ(楊賢慶)，Zhang S(張帥)，Hao SX(郝淑賢)et al.Optimization of Extraction and Physicochemical Properties ofTilapiaSkin Collagen.Food Sci(食品科學(xué))，2009，16: 106-111.

12 Duan R(段蕊)，Zhang JJ(張俊杰)，Jin YJRY(今野久仁彥)et al.Characteristics Comparison of Pepsin-soluble Collagen from Skin and Bone ofCarp(Cyprinus Carpio).Food Ferm Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2008，5:10-13.

13 Zhang H(張虹)，Zhuo SZ(卓素珍)，Dai ZY(戴志遠(yuǎn)).Extraction and Characterization of Collagen fromAnglerfish(Lophius Litulon)Skin.J Chin Inst food Sci Technol(中國(guó)食品學(xué)報(bào))，2009，9(6):34-41.

14 Liu LL(劉麗莉)，Ma MH(馬美湖)，Yang XL(楊協(xié)力).Extraction and Characterization of TypeⅠCollagen fromBovineBone.Food Sci(食品科學(xué))，2010，2:87-92.

15 Yan MY，Li BF，Zhao X，et al.Characterization of acid-soluble collagen from the skin ofwalleye pollock(Theragra chalcogramma).Food Chem，2008，107:1581-1586.

16 Wang L，An XX，Yang FM，et al.Isolation and characterisation of collagen from the skin，scale and bone of deep-sea red fish(Sebastes mentella).Food Chem，2008，108:616-623.

17 Muyonga JH，Cole CGB，Duodu KG.Fourier transform infrared(FTIR)spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adultNile perch(Lates niloticus).Food Chem，2004，86:325-332.

Extraction and Characterization of Collagen from Skin of Sepia esculenta

LEI Jing，LI He-sheng*，ZHANG Li-yuan，SUN Nan-nan
Ningbo University，College of Life Science and Biotechnology，Ningbo 315211，China

In order to take full advantage of cuttlefish(Sepia esculenta)processing waste，the basic components of cuttlefish skin were analyzed and the extraction conditions for collagen from cuttlefish skin were optimized.Along with this，purified collagen was analyzed through SDS-PAGE vertical electrophoresis，UV scanning and FT-IR.The results showed that cuttlefish skin contained large amounts of collagen and it could be used as the source of complement for collagen.The optimum conditions for collagen with acid and pepsin were determined as follows:soaking cuttlefish skin in 0.1 mol/ L tartaric acid solution with a ratio of material to liquid of 1∶20(m∶V，raw materials)at 4℃ for 18 h，the 1400 U/g pepsin was added in the beginning for the restriction hydrolysis，and the extraction yield of collagen was 12.08%.SDSPAGE vertical electrophoresis，UV scanning and FT-IR results indicated that the extracted collagen was typeⅠcollagen and the unique triple helical structure of typeⅠcollagen remained well.

collagen;cuttlefish skin;extraction;structure characterization

TS254.9;Q58

A

1001-6880(2012)05-0575-06

2011-07-01 接受日期:2011-11-23

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)(2009C03017-3)

*通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:lihesheng@nbu.edu.cn