李虹，馮雷，劉毅，宋國勇，陳輝，張露

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

2(北京大學(xué)營養(yǎng)與保健食品評價中心，北京，100083)

納豆溶栓效應(yīng)的研究

李虹1，馮雷1，劉毅2，宋國勇1，陳輝1，張露1

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

2(北京大學(xué)營養(yǎng)與保健食品評價中心，北京，100083)

探討了納豆產(chǎn)品的溶栓效應(yīng)。采用凍干納豆粉灌胃，在復(fù)制的大鼠血栓模型上，通過動態(tài)觀察血壓的變化，比較血栓的大小以及檢測纖溶酶原激活物質(zhì)抑制劑(PAI)、組織型纖溶酶原激活物(tPA)活性等指標(biāo)，觀察凍干納豆粉對血栓的作用及其機理。將SD大鼠隨機分5組(N=40)，實驗組用不同濃度的凍干納豆灌胃，同等劑量的蚓激酶設(shè)為陽性對照，用Powerlab/4s描記股動脈血壓，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿中PAI-I及tPA活性。凍干納豆組與正常對照組、單純血栓組相比，復(fù)制血栓前血壓無顯著性差異(P＞0.05)，血栓復(fù)制40min后，凍干納豆組、陽性對照組與單純血栓組血壓相比有顯著性差異(P＜0.001);凍干納豆處理的動物與單純血栓組動物比較，其血栓的濕重、干重顯著性降低(P＜0.001);凍干納豆組、陽性對照組血漿中tPA活性升高，PAI/tPA比值與對照相比顯著降低(P＜0.001)。凍干納豆對動脈血栓的形成有抑制作用。

納豆，冷凍干燥，納豆激酶，溶栓效應(yīng)

血栓的形成是引起心肌梗死、腦卒中等心血管疾病死亡的重要因素之一，控制血栓的形成、增強纖溶活性對心腦血管疾病防治具有重要意義。從膳食成分中發(fā)現(xiàn)和開發(fā)抗栓和溶栓物質(zhì)，具有廣泛的臨床實用價值[1］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，日本人心腦血管疾病的發(fā)病率明顯低于其它民族，這與其傳統(tǒng)飲食習(xí)慣有關(guān)。納豆(Natto)是在日本備受關(guān)注的一類營養(yǎng)食品，它是以大豆為原料，煮熟之后加入納豆菌(枯草桿菌Bacillus subtilis)發(fā)酵制成的一種傳統(tǒng)食品。據(jù)記載，納豆起源于中國，公元753年中國唐代高僧鑒真東渡日本傳經(jīng)時，攜帶了“甜豉”到日本，這種甜豉應(yīng)該就是納豆的前身，至今納豆已經(jīng)有近2000年的食用歷史。納豆類似于我國的豆豉，其營養(yǎng)價值極高。近年來，人們對它廣泛的生物學(xué)作用及其保健功能極為重視。已有研究證明，納豆對心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松、便秘等有預(yù)防和治療效果。1987年Sumi等人發(fā)現(xiàn)，納豆在體內(nèi)外均具有溶栓作用[2-3］，但抗栓效應(yīng)機理還未完全闡明。本研究采用凍干納豆灌胃，在復(fù)制血栓的模型上，觀察其對血栓形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

正常雄性S-D大鼠40只，體重200～250 g左右，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供;凍干納豆，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院;蚓激酶，購于北醫(yī)三院;tPA、PAI試劑盒，購自上海實業(yè)醫(yī)大生物技術(shù)有限公司;其它試劑為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠血栓模型制作及實驗分組

參照Kurz等[4］方法復(fù)制動脈血栓形成模型。大鼠禁食8 h，自由飲水，用20%烏拉坦腹腔注射(5 mL/kg)麻醉，股動脈插管經(jīng)換能器在生理多導(dǎo)儀上監(jiān)測股動脈血壓。腹正中切口，游離約2 cm長的膈下腹主動脈段，用30%FeCl3浸漬過的濾紙(1 cm×1 cm)仔細(xì)包裹腹主動脈(小心保護周圍組織)，30 min后取除濾紙條，10 min后結(jié)束實驗。

實驗分組:⑴單純血栓組:操作見上述;⑵低劑量凍干納豆組:預(yù)先用凍干納豆30 mg/(kg·次)，灌胃，連續(xù)2天，血栓制備同第1組;⑶高劑量凍干納豆組:方法同第2組，但灌胃納豆素劑量為300 mg/(kg·次);⑷蚓激酶組:方法同第2組，但用蚓激酶劑量為30 mg/(kg·次);⑸對照組:操作同第1組，但所覆蓋腹主動脈的濾紙片為生理鹽水浸泡。

1.2.2 監(jiān)測指標(biāo)

⑴血液動力學(xué)、形態(tài)學(xué)檢測及蛋白定量

觀察血壓的變化，實驗結(jié)束時從血栓上端腹主動脈或腎靜脈抽血(股動脈放血)3～5 mL，離心后取血清作生化檢測。結(jié)扎濾紙條覆蓋部位上下端動脈(至少距1 cm以上)，從腹主動脈濾紙覆蓋部位準(zhǔn)確取局部血栓段1 cm，放入蓋玻片上稱其濕重，然后在烤箱內(nèi)(90℃過夜)烤干稱其干重，并將其溶于2 mL堿性NaHCO3溶液中(在0.1mol/L NaOH溶液中含2%Na2CO3)，沸水浴3min，用考馬斯亮藍法蛋白定量，計算血栓的蛋白含量(mg pro/g DW)。

⑵生化指標(biāo)檢測

PAI-1、tPA(上海實業(yè)-醫(yī)大生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))測定:取血2 mL置于含3.8%枸櫞酸鈉200μL的試管中混勻，2500 r/min離心15min，血漿于-20℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法(ELISA)測定，PAI-1的單位以UI/mL表示，tPA的單位以UI/mL表示或用發(fā)色底物法測其活性[5］，PAI-1用發(fā)色底物法測其活性。按試劑盒說明制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測標(biāo)本稀釋后加入平底酶標(biāo)板，然后按說明加入發(fā)色底物、纖溶酶原和加速劑，37℃水浴180 min后終止反應(yīng)，應(yīng)用BIO-RAD型酶標(biāo)儀在405nm波長下測定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算PAI-1活性。PAI-1的正常參考值為(5.94±2.47)AU/mL。tPA活性測定用發(fā)色底物法，按試劑盒說明制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測標(biāo)本稀釋后加入平底酶標(biāo)板，然后按說明加入發(fā)色底物、纖溶酶和加速劑，37℃水浴180 min后終止反應(yīng)，應(yīng)用BIO-RAD型酶標(biāo)儀在405 nm，波長下測定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算tPA活性。血漿tPA抗原測定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法原理測定血漿tPA抗原。按試劑盒說明，將tPA標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確復(fù)溶、倍比稀釋，得濃度為60、30、15、7.5、3.75 ng/mL 五個標(biāo)準(zhǔn)點:將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測血漿100μL加入抗體包被酶標(biāo)板各孔中，37℃孵育150 min后棄去反應(yīng)空內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，拍干，再加入酶標(biāo)抗體100μL，37℃孵育60 min，洗滌3次后拍干，然后每孔加底物100μL，37℃孵育15～20 min后每孔加終止液50μl，在BIORAD型酶標(biāo)儀上492 nm處測定各孔的OD值，以O(shè)D492對tPA標(biāo)準(zhǔn)品濃度在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品tPA抗原水平(ng/mL)可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出tPA抗原的正常參考值為1.0～12.8ng/mL。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用one-way ANOVA作統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較用Student-Newman-Keuls(SNK)方法檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干納豆對血栓形成的影響

本實驗各組血清中tPA、PAI、PGI2、TAX2檢測結(jié)果及血壓、血栓形成情況見表1。

由表1可以看出，與單純血栓組相比較，治療各組血栓濕重、血栓干重和血栓蛋白含量均明顯降低(P＜0.01)，高劑量凍干納豆組與蚓激酶組血栓濕重略低于低劑量凍干納豆組(P＜0.01)，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各實驗組血栓濕重、干重、蛋白定量

2.2 凍干納豆對血壓的影響

由表2看出，血栓組動物股動脈血壓在血栓復(fù)制后較血栓復(fù)制前降低60%(P＜0.01)，表明股動脈嚴(yán)重血栓栓塞，藥物治療各組血栓制作后股動脈血壓降低幅度較單純血栓組明顯輕微(P＜0.01)，而接近對照組血壓水平(P＞0.05)，各治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 實驗動物在復(fù)制前后股動脈血壓變化

2.3 凍干納豆對大鼠血漿中tPA、PAI活性的影響及PAI/tPA比值的變化

由表3可以看出，與對照組相比較，血栓形成(單純血栓組)既激活 PAI也激活 tPA(P均為0.01)，PAI/tPA顯著減少(P＜0.01)，表明內(nèi)源泉性纖溶系統(tǒng)激活。治療各組PAI水平明顯低于，而tPA水平顯著高于單純血栓組(P均小于0.01)，PAI/tPA的比值亦明顯降低(P＜0.01)，高劑量納豆組略高于低劑量納豆組(P＜0.01)，與蚓激酶組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 凍干納豆對大鼠tPA、PAI的水平的影響

3 實驗結(jié)論與分析

由試驗結(jié)果可以看出，凍干納豆組與正常對照組、單純血栓組相比、復(fù)制血栓前血壓無顯著性差異，血栓復(fù)制40 min后，凍干納豆組、陽性對照組與單純血栓組血壓相比有顯著性差異;凍干納豆處理的動物與單純血栓組動物比較，其血栓的濕重、干重顯著性降低;凍干納豆組、陽性對照組血漿中tPA活性升高，PAI/tPA比值與對照相比顯著降低。

tPA為體內(nèi)重要的纖溶激活劑。在血栓形成的過程中，有大量的纖溶酶原(plasminogen，PLG)被吸收入血栓中，形成纖溶酶原/纖維蛋白復(fù)合物。tPA主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的絲氨酸蛋白酶，能選擇性地作用于纖溶酶原/纖維蛋白復(fù)合物，使PLG轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin，PL)，PL能將纖維蛋白(fibrin，F(xiàn)b)裂解成纖維蛋白降解產(chǎn)物，從而溶解血栓。研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)灌胃凍干納豆粉后，血液中的tPA含量升高，大鼠血栓重量減少，說明纖溶系統(tǒng)功能加強，可以降解血栓，因此，納豆凍干粉中含有促進tPA產(chǎn)生的酶-納豆激酶。體內(nèi)同時存在著PAI，在所有的PAI中，以PAI-1最為重要。正常情況下血漿tPA和PAI-1處于動態(tài)平衡狀態(tài)[6］。全血 PAI-1的3/4儲存在血小板中，當(dāng)血小板活化釋放時，PAI-1被釋放到血液中，抑制tPA的活性。血漿PAI-1水平升高與心肌梗死、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等心腦血管病變的形成關(guān)系密切。本研究結(jié)果PAI-1/tPA比顯著降低，也表明對大鼠血栓的降解有促進作用。因此，凍干納豆中存在特異性的酶-納豆激酶對動脈血栓的形成有抑制作用。

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ABSTRACTThis Paper evaluates the thrombolytic effect of freeze-dried Natto products(referred to as:freeze-dried natto)by dynamic measuring the change of blood pressure，the size of thrombus and the activity of plasminogen activator inhibitor substances(PAI)or tissue plasminogen activator(tPA)in the thrombus mode.S-D rats were divided into five groups randomly(N=40)，fed with different concentrations of freeze-dried natto or the same dose of Lumbrokinase respectively.The femoral artery pressures were traced by Powerlab/4s.The PAI and tPA activity were detected by ELISA.The femoral artery pressure of rats fed with freeze-dried natto，fed with Lumbrokinase and fed with normal chow were all at the same level(P ＞0.05).The decrease level of femoral artery pressure of rats fed with freeze-dried natto or Lumbrokinase were lower than the rats fed with normal chow since after the thrombus forming for 40 min(P ＜0.001).The wet weight or dry weight of the thrombus were significantly lower on the rats fed with freezedried natto than that on the rats fed with normal chow(P ＜0.001).Compared with the rats fed with normal chow，the tPA activity increased as well as the PAI/tPA ratio decreased obviously in plasma of the rats fed with freeze-dried natto or Lumbrokinase(P ＜0.001).The freeze-dried natto can inhibit the formation of arterial thrombosis.

Key wordsnatto，freeze-dry，nattokinase，thrombolytic effect

The Study on Thrombolytic Effect of Nattokinase

Li Hong1，F(xiàn)eng Lei1，Song Guo-yong1，Chen Hui1，Zhang Lu1，Liu Yi2
1(China National Research Institute of Food and Fermentation，Beijing 100027，China)
2(Nutrition and Health Food Evaluation Center of Peking University，Beijing 100083，China)

學(xué)士，高級工程師。

2012-02-16，改回日期:2012-03-06