李超波，李文明，楊文華，楊小龍，曹郁生

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)

降解黃曲霉毒素微生物篩選中降解與吸附結(jié)合作用的區(qū)分*

李超波，李文明，楊文華，楊小龍，曹郁生

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)

黃曲霉毒素的污染不僅帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康，因而生物降解真菌毒素一直引人關(guān)注。但在研究黃曲霉毒素微生物降解時(shí)，首先必須要有可靠的方法來判定毒素是被降解還是可逆的吸附結(jié)合。該文在黃曲霉毒素B1(AFB1)降解菌株篩選中，對(duì)區(qū)分降解與吸附結(jié)合作用的方法進(jìn)行了研究，建立了可靠的分析方法，通過比較不同pH的影響，細(xì)胞滅活對(duì)AFB1去除的影響，分析菌株細(xì)胞水洗脫、有機(jī)溶劑萃取后AFB1的變化等方法，有效地排除了生物吸附結(jié)合以及pH的干擾，區(qū)分了降解作用和可逆的吸附作用，這些方法簡(jiǎn)單實(shí)用。據(jù)此，從動(dòng)物糞便中成功篩選到了2株能高效降解AFB1的菌株F4、F7。

黃曲霉毒素B1，微生物降解，吸附結(jié)合，區(qū)分

黃曲霉毒素(aflatoxin)是黃曲霉等真菌產(chǎn)生的具有強(qiáng)毒、致癌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1］，其中以 B1的毒性最強(qiáng)，因而世界衛(wèi)生組織把黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)定為 ΙA 類致癌物質(zhì)[2］。黃曲霉毒素母體的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，其中AFB1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含?個(gè)雙呋喃環(huán)和1個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。前者與毒性和致癌性有關(guān)，后者增強(qiáng)前者的毒性和致癌性。

AFB1清除去毒的方法主要包括化學(xué)法、物理法和生物法。但是化學(xué)法、物理法會(huì)對(duì)食品的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)有不同程度的影響，甚至引起污染。因此利用生物學(xué)方法，尤其微生物降解真菌毒素受到密切關(guān)注。

微生物對(duì)真菌毒素有2種作用方式，一是降解轉(zhuǎn)化，二是吸附結(jié)合。前者是將毒素分解轉(zhuǎn)化生成新的產(chǎn)物，后者則是一個(gè)可逆的過程。因而區(qū)分降解作用和吸附結(jié)合是研究微生物降解毒素的一個(gè)重要的基礎(chǔ)工作。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種微生物對(duì)AFB1有結(jié)合吸附能力，其中對(duì)酵母、乳酸菌的研究較多[3-7］。酵母和乳酸菌可以在細(xì)胞壁和特殊的結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合不同的分子，如大分子物質(zhì)、金屬離子等[6，8］。研究證實(shí)，這些微生物主要是通過細(xì)胞壁吸附毒素，死亡細(xì)胞仍具有結(jié)合能力。有研究指出，酵母細(xì)胞壁的甘露聚糖在對(duì)AFB1的吸附中起著重要作用。和酵母不同，乳酸菌對(duì) AFB1的結(jié)合能力有高度的種特異性[9］，主要與細(xì)胞壁上的肽聚糖組分有關(guān)。這種結(jié)合是可逆的，反復(fù)洗脫或加入有機(jī)溶劑都能使毒素游離出來。

目前對(duì)微生物吸附結(jié)合AFB1的研究較多，而降解方面的報(bào)道很少[10-12］。AFB1的生物降解，是指AFB1分子的毒性基團(tuán)被微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或者酶分解破壞，同時(shí)產(chǎn)生低毒或者無毒的降解產(chǎn)物的過程，毒素生物降解是一種化學(xué)反應(yīng)的過程，完全不同于吸附結(jié)合作用[13］。1966年Ciegler等報(bào)道了Flavobacterium aurantiacum B-184具有降解AFB1的作用[12］。但后來有人認(rèn)為并非真正的降解，而是微生物將氯仿溶性的AFB1轉(zhuǎn)化為水溶性的毒素[14］。Hormisch等[15］從煤田附近污染的土壤樣品中分離到1株能夠降解AFB1的分枝桿菌，進(jìn)一步試驗(yàn)證明其對(duì)AFB1的降解是生物酶解作用。國(guó)內(nèi)有人研究了枯草桿菌、乳酸菌、醋酸菌、面包酵母、釀酒酵母、米曲霉等對(duì)AFB1的降解作用，認(rèn)為枯草桿菌、乳酸菌和醋酸菌的作用最強(qiáng)[16］，但因沒有排除細(xì)胞結(jié)合的作用，是否對(duì)毒素有降解作用尚不能肯定。另外，外界pH的變化尤其堿性環(huán)境也會(huì)引起AFB1的降解。因而在篩選降解AFB1的微生物或者確定毒素是否降解時(shí)，必須利用可靠的方法來排除吸附結(jié)合或者酸堿度變化引起的假陽性結(jié)果，而不能單純根據(jù)試驗(yàn)樣品中毒素量的變化做出判斷。

本研究在AFB1降解菌株篩選中，采用了幾種可行的方法排除微生物的吸附作用以及pH的干擾，有效區(qū)分了降解作用和吸附作用，并應(yīng)用于目標(biāo)菌株的篩選，得到了較好的結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，3K18型Sigma高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)，Sigma公司)，PB-10型精密pH計(jì)(Sartorius公司)。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(以色列，F(xiàn)ermentek公司)，Milli-Q超純水，甲醇、乙腈(色譜純，天津永大化學(xué)試劑)，PVDF 濾膜(0.45 μm 孔徑)。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

菌株:從動(dòng)物糞便樣品中分離出2株具有去除AFB1能力的革蘭氏陰性菌株，編號(hào)為F4和F7。

培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯(pH7.0);發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，8.5 g NaCl，1 g葡萄糖，1 g KH2PO4，pH 6.5，121 ℃滅菌 20 min;菌種保存，營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面?zhèn)鞔?/p>

1.3 AFB1的檢測(cè)與分析

對(duì)Teniola等[17］所描述的方法稍加修改:培養(yǎng)結(jié)束后，反應(yīng)混合液用等體積的二氯甲烷萃取3次，除去二氯甲烷層室溫下氮?dú)饩徍蛽]干，用0.5 mL流動(dòng)相溶解殘余物(濃縮1倍)，過膜處理，混勻進(jìn)樣。進(jìn)樣量20 μL。色譜條件如下:

色譜柱:CAPCELL PAK UG120 RP-C18柱(250×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:V(水)∶V(乙腈)∶V(甲醇)=6∶3∶1;柱溫:30 ℃;流速:1 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):362 nm。

AFB1的去除率計(jì)算:

1.4 AFB1降解與吸附結(jié)合作用的區(qū)分

1.4.1 菌液對(duì)AFB1的去除

取斜面保藏菌種F4、F7分別接種于5 mL種子培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再以5%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，分別取975 μL菌體發(fā)酵液與25 μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)置于滅菌的1.5 mL離心管中，使其毒素終濃度為2.5 μg/mL，以無菌的發(fā)酵培養(yǎng)基加AFB1作為空白對(duì)照，37℃，150 r/min暗處振蕩培養(yǎng)72 h，3次平行。反應(yīng)結(jié)束后，通過離心(6000 r/min，室溫，10 min)去除菌體，取其上清液測(cè)樣。

1.4.2 細(xì)胞和上清液及熱處理對(duì)AFB1的去除作用

試驗(yàn)分為4組:(1)細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)好的F4與F7菌液離心(6000 r/min，4℃，10 min)得到菌體細(xì)胞，用PBS溶液(10 mmol/L，pH 7.0)充分洗滌2次，然后重懸于PBS(10 mmol/L，pH7.0)中，使溶液中的細(xì)胞數(shù)分別為1×109CFU/mL和5×109CFU/mL。(2)上清液。(3)細(xì)胞懸液和上清液熱處理組。取細(xì)胞懸液和上清液分別置于100℃水浴中，10 min，進(jìn)行熱處理。

分別取 25 μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/mL)添加到975 μL上述處理的4種液體中，使其毒素終濃度為2.5 μg/mL，以 PBS(10 mmol/L，pH 7.0)代替細(xì)胞懸液及上清液作為對(duì)照，37℃，150 r/min暗處振蕩培養(yǎng)72h，3次平行。反應(yīng)結(jié)束后，菌體細(xì)胞通過離心去除(6000 r/min，室溫，10 min)。

1.4.3 毒素洗脫萃取試驗(yàn)

以PBS液和含2.5 μg/mL AFB1的PBS作為對(duì)照，將與毒素作用后的細(xì)胞分散于1.0 mL PBS(10 mmol/L，pH 7.0)中，37 ℃保溫 10 min，離心，重復(fù)處理3次，用HPLC分析每次被洗脫下來的AFB1。同時(shí)以二氯甲烷萃取后的含2.5 μg/mL AFB1的PBS作為對(duì)照，將與毒素作用后的細(xì)胞用1.0 mL二氯甲烷萃取3次，除去二氯甲烷層室溫下氮?dú)饩徍蛽]干，用0.5 mL流動(dòng)相溶解殘余物(濃縮1倍)，過膜處理，利用HPLC檢測(cè)萃取到的AFB1。根據(jù)結(jié)果計(jì)算洗脫率，分析其降解和吸附結(jié)合作用。

1.5 pH值的影響和排除

pH變化對(duì)黃曲霉毒素降解有著很大影響，而所用的2株菌在培養(yǎng)中會(huì)引起pH值上升，為了控制培養(yǎng)過程中pH變化的影響，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，使之在培養(yǎng)過程中能維持pH的穩(wěn)定，以排除干擾。以空白 PB緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)以及Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 依次為 7.5，8.0，8.5，9.0)與AFB1作用作為對(duì)照(作用條件與1.4.1相同)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本研究采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不同組之間的差異性采用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和討論

對(duì)分離的具有降解AFB1活性的2株細(xì)菌F4和F7進(jìn)行了考察，以確定其對(duì)毒素是否有真正的降解作用。

2.1 AFB1降解與吸附結(jié)合作用的區(qū)分

2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)液中AFB1的去除

F4和F7菌株48 h的培養(yǎng)液中添加2.5 μg/mL AFB1，37 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 h，取樣檢測(cè)分析，結(jié)果表明，兩株菌對(duì)AFB1的去除率分別達(dá)到90.03%和84.56%，見表1。可見2菌具有良好高效的去毒活性。接著做進(jìn)一步的試驗(yàn)，以排除吸附結(jié)合或者環(huán)境條件的作用。

表1 菌株F4與F7對(duì)AFB1的去除效果

2.1.2 細(xì)胞和上清液及熱處理對(duì)AFB1的去除作用

由圖1可以看出，上清液對(duì)AFB1去除率很低，分別只有10.75%和6.92%。與上清液相比，菌細(xì)胞更能有效地去除AFB1，分別為82.84%和79.07%，接近于細(xì)菌培養(yǎng)液。F4與F7的細(xì)胞或上清液在100℃處理10 min后會(huì)幾乎失去去毒活性。

圖1 菌株F4、F7對(duì)AFB1的去除作用

從菌細(xì)胞與上清液對(duì)AFB1去除效果可以看出，F(xiàn)4與F7去毒主要是細(xì)胞的作用，而上清液作用甚微，一種原因可能是AFB1被胞內(nèi)活性物質(zhì)降解，另一個(gè)原因是毒素被細(xì)胞吸附結(jié)合。上清液對(duì)毒素也有少量的去除作用，這可能是培養(yǎng)過程中有少量細(xì)胞死亡自溶，胞內(nèi)的活性物質(zhì)逸出引起AFB1的去除。

熱處理可導(dǎo)致細(xì)胞去毒活性幾乎消失，這可能是胞內(nèi)活性物質(zhì)酶的失活引起的。為了排除吸附結(jié)合作用，采用水洗脫和溶劑萃取方法做進(jìn)一步分析。

2.1.3 毒素洗脫萃取

對(duì)實(shí)驗(yàn)中與AFB1反應(yīng)的F4和F7細(xì)胞進(jìn)行洗脫試驗(yàn)，PBS重復(fù)洗脫3次，取樣用HPLC分析，均未檢測(cè)到AFB1。由圖2可以看出，用有機(jī)溶劑二氯甲烷對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行萃取，分析發(fā)現(xiàn)分別只有3.17%和3.91%的AFB1被洗脫下來，而對(duì)照組中可萃取到80.60%的AFB1。

圖2 二氯甲烷對(duì)去毒細(xì)胞上AFB1的萃取率

Peltonen等[6］提出乳酸菌吸附結(jié)合去除 AFB1，與細(xì)胞壁形成微弱的非共價(jià)結(jié)合及疏水作用相關(guān)，是一個(gè)可逆的過程，經(jīng)過反復(fù)水洗或者有機(jī)溶劑萃取，毒素可以重新釋放出來。Haskard等[7］發(fā)現(xiàn)，吸附結(jié)合AFB1的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus LC-705)，反復(fù)水洗，可以釋放出38%的毒素;而用三氯甲烷萃取，可以釋放出 98%的 AFB1。Lillehoj等[18］對(duì)具有生物降解AFB1活性的橙色黃桿菌NRRL B-184的活細(xì)胞用水反復(fù)洗脫以及三氯甲烷萃取，均未檢測(cè)到有AFB1。發(fā)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)后的F4、F7活細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)水洗或者二氯甲烷萃取，都幾乎檢測(cè)不到AFB1，因而可以排除細(xì)胞的吸附結(jié)合作用，而是一個(gè)毒素被降解的反應(yīng)過程。這與前人報(bào)道的結(jié)論相符。

2.2 pH的影響和排除

由于堿性環(huán)境中黃曲霉毒素會(huì)被分解，因而在考察降解活性時(shí)必須注意pH變化對(duì)毒素的影響。從圖3可以看出，pH 7.0時(shí)AFB1幾乎無損失;pH 8.5時(shí)有30.43%的AFB1被分解;pH 9.0時(shí)有58.96%的AFB1被分解，pH更高時(shí)可能導(dǎo)致更多的AFB1分解。這可能是在堿性環(huán)境下，AFB1的內(nèi)酯鍵易受親核試劑，尤其是OH-的攻擊，從而引起內(nèi)酯環(huán)的打開造成化學(xué)降解。因而必須注意反應(yīng)液中pH的變化，否則會(huì)影響結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，分離到的活性菌株F4和F7在培養(yǎng)后會(huì)明顯引起培養(yǎng)液pH上升，24 h后達(dá)到8.1(見圖4)，如不加以控制，就會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此對(duì)培養(yǎng)基通過添加0.1%的KH2PO4進(jìn)行改良，初始pH值調(diào)為6.5，從圖4還可以看出，改良之后F4、F7菌株在培養(yǎng)中的pH得到了有效控制，一般維持在了7.0左右，從而有效地排除了pH的干擾。

圖3 pH對(duì)AFB1化學(xué)降解的影響

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)基改良前后培養(yǎng)物pH值的變化對(duì)比

在以上試驗(yàn)中，首先區(qū)分了菌細(xì)胞、上清液的去毒活性，證實(shí)菌細(xì)胞展現(xiàn)了主要活性。然后通過熱處理，以了解加熱滅活后去毒活性的變化，發(fā)現(xiàn)滅活細(xì)胞失去了活性。進(jìn)而再利用洗滌萃取方法作進(jìn)一步證實(shí)，通過這些排除了細(xì)胞的吸附結(jié)合作用，確定了F4和F7菌株是真正有降解活性的細(xì)菌。細(xì)菌對(duì)AFB1的吸附結(jié)合主要是與細(xì)胞壁或者細(xì)胞壁主要成分如多糖、肽聚糖等物質(zhì)對(duì)AFB1的作用相關(guān)，而生物降解去毒是指通過酶促降解或轉(zhuǎn)化AFB1形成無毒或者低毒產(chǎn)物的過程[19］，是一種化學(xué)反應(yīng)過程，完全不同于吸附結(jié)合作用。EL-Nezami等[20］指出，有吸附結(jié)合AFB1能力的鼠李糖乳桿菌，其熱處理死細(xì)胞具有與活細(xì)胞同樣的吸附能力。而F4和F7菌細(xì)胞熱滅活后，基本沒有去毒作用，從而排除了細(xì)胞吸附結(jié)合AFB1的可能性。這提示是細(xì)胞產(chǎn)生的酶或其他代謝產(chǎn)物對(duì)AFB1的降解作用。在此基礎(chǔ)上，對(duì)該菌株的降解活性，相關(guān)的酶或其他活性物質(zhì)，以及代謝產(chǎn)物正在做更深入的研究。

3 結(jié)論

本文在AFB1降解菌株篩選中，對(duì)區(qū)分降解作用與吸附結(jié)合的方法進(jìn)行了研究。通過比較不同pH的影響，細(xì)胞滅活對(duì)AFB1去除的影響，分析菌株細(xì)胞水洗脫、有機(jī)溶劑萃取后AFB1的變化等方法，有效地排除了生物吸附結(jié)合以及pH的干擾，區(qū)分了降解作用和可逆的吸附作用。將這些方法應(yīng)用于目標(biāo)菌株的篩選，從樣品中成功篩選到了2株具有高效降解AFB1活性的菌株F4和F7。

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ABSTRACTAflatoxin contamination not only leads to serious economic losses，but also is detrimental to human and animal health.Much attention has been paid to mycotoxins biodegradation in recent years.For investigation of microbial detoxification，however，a reliable method is needed to decide whether the toxin is degraded or reversibly bound.In this paper，several methods were tested to differentiate the degrading AFB1from adsorbing during the screening of aflatoxin B1-degrading microbes.Through comparing the AFB1detoxification differences between living cells and dead cells，analyzing the residual AFB1from microbial cells by aqueous washing and organic solvent extracting，and maintaining a stable pH of medium，we have effectively excluded the biological adsorbing and binding and pH interferences，and distinguished the degradation from the reversible adsorbing.It has been demonstrated that F4 and F7 strains have high AFB1degradation activity.

Key wordsaflatoxin B1，biodegradation，adsorb and bind，distinguish

Distinguishing Degradation from Binding of AFB1in Screening of Aflatoxin-degrading Microorganisms

Li Chao-bo，Li Wen-ming，Yang Wen-hua，Yang Xiao-long，Cao Yu-sheng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

碩士研究生(曹郁生教授為通訊作者，E-mail:yyssccc@hotmail.com)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060022)

2011-12-28，改回日期:2012-03-21