楊 蘭

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300）

固態(tài)發(fā)酵結(jié)合酶解技術(shù)制備花生肽及其促生長(zhǎng)活性的研究

楊 蘭

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300）

通過(guò)米曲霉固態(tài)發(fā)酵花生粕，結(jié)合酶解與冷凍干燥技術(shù)，制備花生肽。促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明，以0.5%添加分子量小于3ku的花生肽對(duì)保加利亞乳桿菌的促生長(zhǎng)作用更為明顯，其中乳桿菌的活菌數(shù)可提高1個(gè)數(shù)量級(jí)，凝乳效果改善，乙醛含量增加。比較氨基酸組成結(jié)果表明，該技術(shù)可有效提高氨基酸含量，改善氨基酸組成，乳桿菌生長(zhǎng)必需的氨基酸含量達(dá)33.61～226.33mg/g。

花生肽，促生長(zhǎng)，保加利亞乳桿菌，固態(tài)發(fā)酵

Abstract：Peanut peptide was made through solid state fermentation with Aspergillus oryzae on peanut meal and combination of enzymatic and freeze-drying technology.In the growth-promoting experiments，0.5%peanut peptide （Mw＜3ku） gave better activity on Lactobicillus bulgaricus，including that the number of viable cells raised by an order of magnitude，better coagulatin effects and increased acetaldehyde contents.Comparison of amino acid revealed that the contents and composition were improved through the method，including that the contents of essential amino acids（33.61～226.33mg/g） for Lactobacillus bulgaricus were observed.

Key words：peanut peptides；growth-promoting；Lactobacillus bulgaricus；solid-state fermentation

花生是最重要的油料作物之一，榨油后產(chǎn)生大量的花生粕其中蛋白含量達(dá)45%以上[1]。但由于花生蛋白易嚴(yán)重變性，且具有氨基酸構(gòu)成不太平衡、易受黃曲霉毒素污染等問(wèn)題，花生粕大多數(shù)都被作為飼料使用[2]。生物活性肽對(duì)微生物的促生長(zhǎng)作用日益受到關(guān)注[3-4]，其制備方法主要包括外加酶解、微生物發(fā)酵等。與外加酶解法用酶單一、成本較高、產(chǎn)物苦味難以消除、液態(tài)發(fā)酵法投入成本大、排放污水多[5]相比，固態(tài)發(fā)酵使用的基質(zhì)含水量低，不需要廢水處理，并且直接利用微生物代謝產(chǎn)生的綜合酶系，可大大降低生產(chǎn)成本，其發(fā)酵過(guò)程也不需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作，具有明顯優(yōu)勢(shì)[6]。同時(shí)米曲霉是一種易培養(yǎng)、產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，具有高強(qiáng)度啟動(dòng)子、很強(qiáng)的蛋白分泌能力[7]，其細(xì)胞內(nèi)滲透壓較高，在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用較其他菌種更為廣泛[8-9]。本次研究首先通過(guò)米曲霉固體發(fā)酵花生粕，利用代謝產(chǎn)生的以蛋白酶為主的綜合酶系直接酶解花生粕，制得具有生物活性的花生肽，并進(jìn)一步研究花生肽對(duì)保加利亞乳桿菌的促生長(zhǎng)作用，以提高花生粕的附加值，為制備高質(zhì)量的花生粕促生長(zhǎng)肽提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉（Aspergillus oryzae）M-11、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 廣東輕院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；MRS液體培養(yǎng)基 葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，牛肉浸膏10g，乙酸鈉5g，吐溫80 1g，檸檬酸二銨2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO42.0g，MnSO4·4H2O 0.05g，加水至1000mL，121℃滅菌15min；桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基[10]蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，吐溫80 1g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20.0g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，瓊脂15g，溶于1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH5.4，過(guò)濾攪拌加熱至沸，分裝試管，121℃滅菌15min；脫脂復(fù)原乳 乳固體含量11%；花生粕 山東魯花集團(tuán)。

LG10-2.4A高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；FD-4冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BT00-300M蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司；Vivaflow 200超濾裝置 美國(guó)Vivascience公司；瑞利UV1801紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利公司；Agilent 1100液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件 色譜條件 PICO TAG氨基酸分析柱；柱溫40℃；洗脫液A pH6.4醋酸鈉緩沖液；洗脫液B 60%（v/v）乙腈；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

1.2.2 工藝流程 制備米曲霉孢子懸液→制備種曲→制備花生粕曲→水解→膜分離、凍干得花生肽粉

1.2.3 操作要點(diǎn)

1.2.3.1 制備孢子懸液 將10mL無(wú)菌水加至30℃培養(yǎng)3d的豆汁斜面，用已滅菌的接種環(huán)在培養(yǎng)基表面輕輕刮動(dòng)，制成孢子懸液，混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)孢子數(shù)，調(diào)整孢子懸液的孢子數(shù)為5.0×106個(gè)/mL。

1.2.3.2 制備麩皮種曲 麩皮100g及水100mL，拌勻后分裝于250mL三角瓶中，添加1.00%葡萄糖、0.10%氯化鈣、0.05%硫酸鋅、3.00%豆粕，每瓶20g（約1～2cm厚），121℃滅菌20min，趁熱打散，降至室溫后接種孢子懸液，于28～30℃培養(yǎng)72h。

1.2.3.3 制作花生粕曲 稱取1000g花生粕（潤(rùn)水、蒸煮并放涼至40℃左右）、0.75g種曲、100g麩皮，完全混勻，于32℃、RH 90%～95%條件下分別培養(yǎng)28、32、36、40、44h，測(cè)定花生粕曲蛋白酶活，以U/g花生粕曲干重表示。

1.2.3.4 花生粕曲水解 將培養(yǎng)好的花生粕曲打散，加入相當(dāng)于花生粕曲4倍重量的水，于55℃水解9h，每隔1h測(cè)定花生肽得率。

1.2.3.5 膜分離與冷凍干燥 將水解液進(jìn)行膜分離，其中膜的截留分子量為（Molecular Weight cut Off）10、3ku，蠕動(dòng)泵（BT00-300M）轉(zhuǎn)速為30r/min，共收集得到三個(gè)組分，即組分Ⅰ（Mw＞10ku）、Ⅱ（10ku＞Mw＞3ku）、Ⅲ（Mw＜3ku）。將各組分冷凍干燥后得花生肽粉，密封保存于4℃冰箱內(nèi)

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 蛋白酶活的測(cè)定 采用福林酚試劑法[11]。

1.2.4.2 花生肽得率的測(cè)定 以三氯乙酸（TCA）氮溶解指數(shù)表示[12]，計(jì)算公式見(jiàn)式（1）：

式中：N1──水解液在10%TCA中可溶性氮的含量，mg；N0──水解液中總氮的含量，mg。

1.2.4.3 OD值的測(cè)定 以生理鹽水為調(diào)零基準(zhǔn)，用UV1801型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)625nm測(cè)發(fā)酵液OD值。

1.2.4.4 pH的測(cè)定 用pHS-25型酸度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH，每次使用前用pH6.86和pH4.00標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校準(zhǔn)酸度計(jì)。

1.2.4.5 活菌數(shù)的測(cè)定 桿菌以3%接種于脫脂復(fù)原乳培養(yǎng)基中，于42℃恒溫培養(yǎng)。在無(wú)菌操作條件下，將發(fā)酵液充分混勻，移取1mL發(fā)酵液及9mL稀釋液（0.1%胰蛋白胨溶液）置于試管內(nèi)，并在渦流儀上充分混勻，依次做10倍遞增稀釋至合適的稀釋度（預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。吸取1mL稀釋后的發(fā)酵液于滅菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中，做三個(gè)平行樣，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h計(jì)數(shù)。

1.2.4.6 乙醛含量的測(cè)定 取發(fā)酵液40mL，加入等體積16%三氯乙酸溶液，以轉(zhuǎn)速3500r/min離心10min，過(guò)濾后得待測(cè)上清液。精確量取1%NaHSO3溶液5.00mL置于錐形瓶中，加入待測(cè)上清液25mL，搖勻，室溫放置1h后，加入1%淀粉溶液1mL，用0.1mol/L碘液滴定至近終點(diǎn)時(shí)，用0.01mol/L碘液滴定至淺藍(lán)紫色。再加1mol/L NaHCO3溶液20mL，振蕩混勻0.5min，用0.01mol/L碘（1/2 I2）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)紫色，記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)碘液體積，同時(shí)用脫脂復(fù)原乳做空白試驗(yàn)，每樣品至少做3次平行滴定，取平均值。計(jì)算公式見(jiàn)式（2）：

式中：V（1/2I2）——滴定上清液時(shí)消耗碘（1/2 I2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0——空白滴定時(shí)消耗碘（1/2 I2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C（1/2I2）——碘（1/2 I2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L。

1.2.4.7 雙乙酰含量的測(cè)定 將11%的脫脂復(fù)原乳121℃滅菌7min后迅速冷卻，用于配制濃度分別為0、10、20、30、40、50mg/L的雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)液。取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液按如下方法操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：加等體積的16%三氯乙酰溶液，混勻，以轉(zhuǎn)速3500r/min離心10min，取上清液20mL分別加入到2支（1號(hào)和2號(hào)）試管中，向1號(hào)管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.5mL，2號(hào)管不加，搖勻后置于黑暗處放置30min，然后各加入4.0mol/L HCl溶液2.0、2.5mL以終止反應(yīng)，混勻后以不加鄰苯胺的2號(hào)管的溶液作為參比液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在335nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每樣至少做2個(gè)平行，取平均值，然后以雙乙酰濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用發(fā)酵液代替脫脂復(fù)原乳，測(cè)定發(fā)酵液中雙乙酰濃度。

1.2.4.8 氨基酸組成的測(cè)定 用6mol/L鹽酸溶液水解待測(cè)樣品，0.45μm微濾膜過(guò)濾，Agilent 1100液相色譜儀測(cè)定樣品氨基酸組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生肽的制備

2.1.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)成曲蛋白酶活的影響 花生粕曲的制作時(shí)間應(yīng)根據(jù)所用菌種、制曲工藝來(lái)決定。在本次研究中采用米曲霉，其最適生長(zhǎng)溫度為32～35℃，溫度過(guò)低則低溫型微球菌、毛霉菌等容易生長(zhǎng)；溫度過(guò)高則枯草芽孢桿菌、根霉等耐高溫的微生物容易生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生氨味。另外，考慮到成曲制作時(shí)，曲料的厚度會(huì)使得制曲過(guò)程中放出的熱量不能及時(shí)排出，并結(jié)合筆者前期對(duì)米曲霉制曲的研究經(jīng)驗(yàn)，選用32℃進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 制曲時(shí)間對(duì)花生粕曲中性及酸性蛋白酶活的影響Fig.1 Effect of koji-making time on neutral and acidic protease activity of peanut meal koji

2.1.2 不同水解時(shí)間對(duì)花生肽得率的影響 米曲霉代謝生成的蛋白酶最適水解溫度為50～55℃，且在適宜溫度范圍內(nèi)，較高的溫度有助于提高水解的速度，因此將制好的花生粕曲加相當(dāng)于4倍重量的水于55℃進(jìn)行水解，觀察其花生肽得率的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 水解時(shí)間對(duì)花生肽得率的影響Fig.2 Effect of hydrolyzing time on peanut peptide yield

圖2中可以看出，隨著水解時(shí)間的增加，TCA-NSI逐漸增加，在7h達(dá)最大值88.45%。在水解時(shí)間超過(guò)7h后，花生肽得率保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，這是因?yàn)殡S著水解底物蛋白的減少，生成的花生肽逐漸增加，抑制了水解反應(yīng)，甚至?xí)霈F(xiàn)部分水解產(chǎn)物又重新聚合的現(xiàn)象。TCA-NSI的高低反映了水解產(chǎn)物的生化特性及肽鏈的長(zhǎng)短，一般認(rèn)為T(mén)CA-NSI值越大，肽鏈越短。因此選取7h作為花生肽制備的水解時(shí)間。

2.2 不同分子量范圍的花生肽對(duì)MRS培養(yǎng)基中乳桿菌生長(zhǎng)的影響

將保加利亞乳桿菌按3%（v/v）接種于含有不同分子量段花生肽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃有氧培養(yǎng)24h，在625nm下測(cè)量培養(yǎng)基的OD值與pH，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，與對(duì)照組相比，不同分子量范圍的花生肽均使得OD值提高、pH下降。添加組培養(yǎng)基OD值增加至0.95～1.12，對(duì)于蛋白分解能力較弱的桿菌而言，在MRS培養(yǎng)基中添加富含肽的蛋白水解物，作為乳桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中所需的氮源，是能夠促進(jìn)乳桿菌增殖和發(fā)酵的有效途徑。另外，添加花生肽也使培養(yǎng)基的pH下降較對(duì)照組更為明顯，原因可能是由于氮源利用效率提高，乳桿菌活力增強(qiáng)導(dǎo)致產(chǎn)酸能力增強(qiáng)，同時(shí)乳桿菌總量的增加也導(dǎo)致總酸量的增加。

圖3 不同分子量花生肽對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of peanut peptides with different moleculer weight on growth of L.bulgaricus in MRS

圖3表明，分子量小于3ku的花生肽對(duì)培養(yǎng)基的OD值、pH的影響相較其他分子量范圍的肽更為明顯。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)不同分子量肽段對(duì)微生物的促生長(zhǎng)作用有明顯差異，如St-Gelais等[13]報(bào)道肽鏈的長(zhǎng)短是決定肽促乳酸菌生長(zhǎng)活性強(qiáng)弱的一個(gè)重要因素，Proulx等[14]發(fā)現(xiàn)分子量小于2ku的肽段對(duì)于B.ifidubactreia的生長(zhǎng)最為有利，王洪榮[15]認(rèn)為分子量小于3ku的魚(yú)粉肽和豆粕肽對(duì)瘤胃細(xì)菌和原蟲(chóng)的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，能提高瘤胃中的蛋白酶活。因此，將以分子量小于3ku的花生肽作為下一步研究對(duì)象。

2.3 花生肽添加量對(duì)發(fā)酵乳的影響

分別添加0、0.2%、0.5%、1.0%、1.8%、3.0%花生肽于脫脂復(fù)原乳中，接種保加利亞乳桿菌，于42℃培養(yǎng)，觀察凝乳時(shí)間和凝乳效果，測(cè)定凝乳時(shí)活菌數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 不同添加量對(duì)脫脂復(fù)原乳中活菌數(shù)及凝乳效果的影響Table 1 Effect of different amounts on the number of viable cells and coagulating in reconstituted skim milk

表1表明，隨著花生肽的添加，脫脂復(fù)原乳培養(yǎng)基出現(xiàn)活菌數(shù)增加、凝乳時(shí)間縮短及凝乳效果增強(qiáng)的現(xiàn)象，這主要是由于隨著生成的乳酸增加，pH下降較快，以致α-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白都傾向于從酪蛋白膠束中解離出來(lái)，疏水作用的排斥作用減少，酪蛋白膠粒開(kāi)始凝聚沉降，出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象。在添加量大于0.5%后，活菌數(shù)的增加變得緩慢，凝乳時(shí)間的變化也不明顯，但出現(xiàn)酸乳黏度下降的現(xiàn)象，可能是隨著pH進(jìn)一步下降及乳桿菌對(duì)蛋白分解作用的增強(qiáng)，微小蛋白質(zhì)亞膠體分子團(tuán)之間的親合連接作用減弱，導(dǎo)致酸乳膠體的剛性降低，出現(xiàn)由膠體分子團(tuán)聚集形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)松散、酸乳黏度降低的現(xiàn)象[16]。

There is also a series of iconic Chinese sculptures as horses, warriors or animals out of fairy tales. These are bronze sculptures partly covered by enamel in different colors. These arte facts are fascinating for those who still can believe in a romantic way of day dreaming.

發(fā)酵乳中生成上百種揮發(fā)物，F(xiàn)riedrich等[17]研究表明乙醛和雙乙酰是對(duì)風(fēng)味影響最大的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵乳中的乙醛和雙乙酰含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 花生肽對(duì)脫脂復(fù)原乳發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of peanut peptide on volatile components in fermented milk

乙醛的生成主要通過(guò)Threonine aldolase途徑，將蘇氨酸轉(zhuǎn)變成甘氨酸和乙醛，添加組中可能由于花生肽的水解等原因使蘇氨酸含量增加[18]，乙醛含量達(dá)20～25μg/mL，對(duì)生成乙醛有一定的促進(jìn)作用。雙乙酰含量則由糖代謝生成的丙酮酸或乳中所含檸檬酸來(lái)決定，由圖4可以看出，保加利亞乳桿菌發(fā)酵生成雙乙酰的能力明顯低于乙醛，且肽的添加也未帶來(lái)明顯變化。

對(duì)于發(fā)酵乳風(fēng)味而言，雙乙酰和乙醛的比例對(duì)酸奶的風(fēng)味影響也很大，如Zouari等[19]認(rèn)為兩者比例為1∶1時(shí)，具有典型酸奶風(fēng)味，而B(niǎo)ottazzi[20]認(rèn)為乙醛與丙酮比例為2.8∶1時(shí)，可獲得所期望的濃郁風(fēng)味。實(shí)際上國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于產(chǎn)生酸奶最佳風(fēng)味所需各物質(zhì)的濃度和比例進(jìn)行了大量的探索，但目前尚未取得一致結(jié)論[21]。本次研究中兩者比值均大于1，這也與發(fā)酵時(shí)僅使用了單一菌種（保加利亞乳桿菌）且保加利亞乳桿菌產(chǎn)雙乙酰的能力較差有關(guān)。考慮到酸奶實(shí)際生產(chǎn)與冷藏期間，由于多種微生物的持續(xù)作用，其風(fēng)味物質(zhì)的含量和比例還會(huì)繼續(xù)變化，對(duì)風(fēng)味的最終影響還有待于進(jìn)一步研究。

2.4 花生肽對(duì)脫脂復(fù)原乳中保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)代謝規(guī)律的影響

將桿菌以3%接種于含0.5%花生肽的脫脂復(fù)原乳培養(yǎng)基中，在42℃恒溫培養(yǎng)，并分別于0、4、8、12、16、20h取發(fā)酵液，觀察保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)代謝規(guī)律，測(cè)定發(fā)酵液中活菌數(shù)、pH，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著保加利亞乳桿菌發(fā)酵的進(jìn)行，添加組的保加利亞乳桿菌增殖速度明顯變快，發(fā)酵4h后，添加組與對(duì)照組的活菌數(shù)差異較明顯，之后始終高于對(duì)照組0.5～1個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖5 花生肽（Mw＜3ku）對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)代謝的影響Fig.5 Effect of peanut peptides with Mw＜3ku on growth of L.bulgaricus

保加利亞乳桿菌為化能異養(yǎng)型微生物，營(yíng)養(yǎng)要求較為苛刻，需要寡肽、氨基酸、維生素和嘌呤等物質(zhì)及其它生長(zhǎng)因子才能獲得良好生長(zhǎng)。保加利亞乳桿菌利用外加氮源主要發(fā)生在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，此時(shí)添加了肽的培養(yǎng)基中氨基酸和寡肽處于較高水平，對(duì)乳桿菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的刺激作用。隨著乳桿菌的生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量的增加，菌株水解脫脂復(fù)原乳中的蛋白質(zhì)釋放出氨基酸及寡肽，pH也隨著其主要代謝產(chǎn)物乳酸的累積而迅速下降。但由于肽的添加，將緩解發(fā)酵液的pH下降趨勢(shì)，20h左右添加組與對(duì)照組的pH差別縮小。

2.5 花生肽的氨基酸組成

花生肽主要是由寡肽和部分游離氨基酸組成的混合物，既可為乳桿菌生長(zhǎng)提供氨基酸來(lái)源，又能夠從培養(yǎng)基中以肽轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入細(xì)胞以促進(jìn)生長(zhǎng)。將花生肽與花生粕中的氨基酸進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，經(jīng)過(guò)水解后，花生肽中各種氨基酸含量均有所提高，氨基酸比例適當(dāng)，并且乳桿菌生長(zhǎng)必需的谷氨酸、天門(mén)冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸含量較高，在226.33mg/g與33.61mg/g之間，是促進(jìn)保加利亞乳桿菌增殖的有效氮源補(bǔ)充物。可為乳桿菌生長(zhǎng)提供很好的短肽和氨基酸來(lái)源，可以認(rèn)為固態(tài)發(fā)酵結(jié)合酶解技術(shù)是提高花生蛋白氨基酸含量的有效途徑之一。

但需要指出的是，乳酸菌的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)由胞處定位的絲氨酸蛋白酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和部分胞內(nèi)肽酶組成，寡肽的運(yùn)輸是氮源進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要途徑之一，如白鳳翎[22]的研究發(fā)現(xiàn)以分子量小于5ku的大豆蛋白水解物代替全價(jià)氨基酸可以使保加利亞和乳桿菌細(xì)胞密度增加到5倍，最大增長(zhǎng)速率增大1倍，因此研究花生肽（尤其是短肽）的組成與氨基酸序列對(duì)保加利亞乳桿菌促生長(zhǎng)的影響將成為下一步工作的主要目標(biāo)。

表2 花生肽（Mw＜3ku）與花生粕的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of peanut meal and peanut peptide（Mw＜3ku）

3 結(jié)論

3.1 研究了利用米曲霉固體發(fā)酵花生粕，產(chǎn)生以蛋白酶為主的綜合酶系后，加水至花生粕曲中，確定花生粕曲的制作時(shí)間為36h。利用粕曲自身產(chǎn)生的蛋白酶進(jìn)行水解花生粕蛋白，確定水解溫度為55℃，水解時(shí)間為7h。將水解液按分子量進(jìn)行分離后，冷凍干燥得花生肽，本工藝具有成本低、廢液少、易操作等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 分子量范圍在小于3ku的花生肽，用量為0.5%時(shí)促生長(zhǎng)的效果最好，其生長(zhǎng)曲線表明，活菌數(shù)比對(duì)照組增加1個(gè)數(shù)量級(jí)，pH下降速度增加，對(duì)風(fēng)味物質(zhì)如乙醛的生成也有一定的促進(jìn)作用。

3.3 氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，花生肽中氨基酸比例適當(dāng)，其中乳桿菌生長(zhǎng)必需的氨基酸如天門(mén)冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等含量較高，是促進(jìn)增殖的有效氮源補(bǔ)充物。

[1]梅娜，周文明，胡曉玉，等．花生粕營(yíng)養(yǎng)成分分析[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（3）：96-99.

[2]張吉民，王秀貞，楊偉強(qiáng)，等．花生粕在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．第五屆全國(guó)花生學(xué)術(shù)研討會(huì)，2007．

[3]Setin I，Svein J H，Vincent G H E．Hydrolysates from Atlantic cod（Gadus morhua L.） viscera as components of microbial growth media[J].Process Biochemistry，2005，40（12）：714-722.

[4]Russi S P，Wallace R J，Newbold C J.Influence of the pattern of peptide supply on microbial activity rumen simulating fermenter（RUSITEC）[J].British Journal of Nutrition，2002，88：73-80.

[5]秦思思，宋俊梅，劉天蒙．發(fā)酵豆粕制備大豆肽飲料發(fā)酵條件的研究[J]．中國(guó)釀造，2011，233（8）：129-132.

[6]Kumar S， Sharma H K， Sarkar， B C.Effect of substrate and fermentation conditions on pectinase and cellulase production by Aspergillus niger NCIM 548 in submerged（SmF） and solid state fermentation（SSF）[J].Food Science and Biotechnology，2011，20（5）：1289-1298.

[7]劉麗，劉謹(jǐn)，唐國(guó)敏．絲狀真菌外源基因表達(dá)分泌系統(tǒng)的受體菌的構(gòu)建[C]．武漢：首屆中國(guó)青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)，2002：57.

[8]Kazunari I，Tomoka K，Hiroyuki S，et al.Uniform culture in solid-state fermentation with fungi and its efficient enzyme production[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111（3）：300-305．

[9]秦衛(wèi)東，陳學(xué)紅，馬利華，等．黑曲霉發(fā)酵豆粕制備抗氧化肽研究[J].食品科學(xué)，2010，31（23）：289-293.

[10]趙強(qiáng)忠，趙謀明，蔣文真．一種分離和檢測(cè)酸乳中乳酸菌的有效方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（3）：96-99.

[11]上海釀造科學(xué)研究所.發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998：70-72.

[12]姜紹通，羅蕾蕾，潘牧，等．菜籽粕分步酶解制備水解產(chǎn)物的研究[J]．食品科學(xué)，2009，30（10）：52-55.

[13]St-Gelais D，Roy D，Haché S，et al.Growth of nonproteolytic Lactococcus lactis in culture medium supplemented with different casein hydrolysates[J].Journal of Dairy Science，1993，76：3327-3337.

[14]Proulx M，Ward P，Gauthier S F，et al.Comparison of bifidobacterial growth-promoting activity of ultrafiltered casein hydrolyzate fractions[J].Lait，1994，74（2）：139-152.

[15]王洪榮，孫桂芬，盧德勛，等．飼料源活性肽混合物的提取及其對(duì)綿羊瘤胃微生物生長(zhǎng)的影響[J]．動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006，18（4）：252-260.

[16]沈輝，Celestin S，Etienne N，等．酸乳發(fā)酵凝乳過(guò)程中的理化性質(zhì)和生物活性[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，19（5）：443-445.

[17]Friedrich J E，Acree T.Gas chromatography olfactometry（GC/O） of dairy products[J].International Dairy Journal，1998，8（3）：235-241.

[18]Lees G J，Jago G R.Formationof acetaldehyde from threonine by lactic acid bacteria[J].Journal of Dairy Research，1976，43（1）：75-83.

[19]Zouari A，Desmazeaud M J.Characterization of lactic acid bacteria isolated from Greek yogurts.2.Strains of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and mixed cultures with Streptococcus salivarius subsp thermophilus[J].Lait，1991，71：463-482.

[20]Bottazzi V，Vescovo V M.Carbonyl compounds produced by yogurt bacteria[J].Neth Milk Dairy J，1969，23：71-78.

[21]Boelrijk A E M，Jong C de，Smit G.Dairy Processing-Improving Quality[M].New York：CRC Press，2003：130-154.

[22]白鳳翎.蛋白水解物促乳酸菌增殖及高密度培養(yǎng)體系研究[D]．北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010．

Study on peanut peptides preparation through solid-state fermentation combined with enzyme hydrylyzing and growth-promoting activity

YANG Lan
（Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China）

TS201.3

A

1002-0306（2012）16-0199-05

2012-05-07

楊蘭（1974-），女，博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)。