高興海，陳湘來

（南京雨潤食品有限公司深加工品管部檢測中心，江蘇南京210041）

反相液相色譜法測定膏狀香精中鄰苯二甲酸酯類

高興海，陳湘來

（南京雨潤食品有限公司深加工品管部檢測中心，江蘇南京210041）

采用反相液相色譜法研究了膏狀香精中鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二正丁基酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）4種鄰苯二甲酸酯的萃取條件。利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響萃取總量的3個(gè)主要因素（正己烷用量、超聲時(shí)間、水浴溫度）進(jìn)行了優(yōu)化，確定了萃取的最佳條件：正己烷用量10mL，超聲時(shí)間25min，水浴溫度15℃。結(jié)果表明，該分析條件下，樣品豬骨膏、牛肉膏的加標(biāo)回收率為90%～94%。用乙腈-水等梯度洗脫（75∶25），4種PAEs分離較好，在0.5～20mg/L之間，色譜峰面積與4種鄰苯二甲酸酯的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

鄰苯二甲酸酯，反相高效液相色譜，膏狀香精

Abstract：Four phthalate acid esters in cream essence，such as dimethyl phthalate（DMP），diethyl phthalate（DEP），dibutyl phthalate（DBP） and benzyl butyl phthalate（BBP），were determined by reverse phase liquid chromatography.The conditions for extraction were researched.Orthogonal design experiment was carried out to optimize the 3 dominant factors（hexane volume，ultrasonic time，water temperature） affecting extraction recovery.The optimum conditions for solid phase extraction were determined as follows：hexane volume 10mL，ultrasonic time 25min，water temperature 15℃.Results showed that the recoveries of the four phthalates were 90%～94%.There was a good linear relationship between peak area and concentration of 4 phthalate esters in range of 0.5～20mg/L.

Key words：phthalate esters；reverse phase liquid chromatography；cream essence

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）又稱酞酸酯，是鄰苯二甲酸酐與醇的反應(yīng)產(chǎn)物，在塑料工業(yè)中常用作增塑劑和軟化劑，用來增大塑料的可塑性和韌性[1-2]。該類化合物為無色透明的油狀液體，無味或略帶氣味，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，是一種具有生物毒性和發(fā)育毒性的環(huán)境雌激素，屬持久性有機(jī)污染物，而且能通過食品生產(chǎn)過程、包裝環(huán)節(jié)進(jìn)入食物鏈，并在人體內(nèi)富集，致使人體肢體畸形、內(nèi)分泌失調(diào)、致癌以及生殖系統(tǒng)病變[3]。目前對(duì)水、牛奶、食用油中PAEs的檢測方法以及含量的研究較多[4-5]，但有關(guān)食品添加劑中半固態(tài)膏狀香精中增塑劑含量的分析研究很少有人報(bào)道。本文采用反相高效液相色譜分析方法，對(duì)半固體膏狀香精中鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二正丁基酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）進(jìn)行定量分析，測定了食品添加劑膏狀香精受PAEs污染的程度，為PAEs的安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二正丁基酯（DBP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）（純度大于99.5%） 德國Dr.Ehrenstoker公司，標(biāo)準(zhǔn)品；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲苯 美國TEDIA公司，色譜純；無水硫酸鈉 上海久億化學(xué)試劑有限公司，分析純；超純水 自制。

Waters2487高效液湘色譜儀（配有Waters 1525真空泵） 美國Waters公司；XTERRA RP18柱 美國Waters公司；超純水發(fā)生器 美國Millipore公司；數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；氮吹儀 鎮(zhèn)江儀器有限公司；固相萃取小柱（500mg/3mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；0.45μm針筒式微膜過濾器 上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取DMP、DEP、DBP、BBP標(biāo)準(zhǔn)品各0.10g，分別用甲醇溶解定容至100mL，配制成1000mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液于棕色容量瓶中。分別移取上述4種單標(biāo)儲(chǔ)備液各1mL，用乙腈定容至10mL，配制成100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 膏狀香精中PAEs的測定

1.3.1 膏狀香精中PAEs的提取 準(zhǔn)確稱取0.5g膏狀香精于試管中，加入一定體積（5～15mL）的正己烷在旋轉(zhuǎn)混合器上混勻，再加入500mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩3min，水浴加熱，超聲一定時(shí)間（15～25min），3000r/min離心10min，吸取上清液于具塞玻璃管中，在油相中加入一定體積正己烷重復(fù)上述步驟一次，合并的上清液作為待凈化液體。

固相萃取方法：a.活化：5mL正己烷；b.上樣：全部待凈化液；c.淋洗：3mL正己烷；d.洗脫：3mL乙酸乙酯∶正己烷∶甲苯（50∶40∶10），洗脫2次，合并洗脫液。

40℃氮吹儀吹至近干，加入1mL乙腈反萃取，渦旋振蕩3min，以4000r/min轉(zhuǎn)速，離心5min，輕輕地將上清液倒入2mL樣品瓶中，再用0.45μm濾膜過濾，高效相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。

1.3.2 HPLC測定條件 色譜柱：XTERRA RP18柱（4.6mm×250mm，5μm）；檢測器，波長226nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL等梯度洗脫，流速1mL/min。

1.4 膏狀香精中PAEs提取條件的確定

對(duì)影響PAEs萃取總量中的溶劑用量，水浴溫度，超聲時(shí)間三因素，分別選取三個(gè)水平，采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

在HPLC同時(shí)檢測多種PAEs時(shí)，首要問題是有效分離各種PAEs。因此，首先考察了不同濃度的乙腈對(duì)4種PAEs分離效果的影響。根據(jù)4種PAEs的極性，在控制流速1mL/min，柱溫30℃不變的情況下通過調(diào)整洗脫液中乙腈和水的比例，使4種PAEs類物質(zhì)基本分離。最終確定乙腈與水的比例為75∶25。從圖1可見4種PAEs類物質(zhì)分離效果較好，且保留時(shí)間都控制在10min以內(nèi)。

圖1 鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of phthalate esters standard

2.2 定量分析

取100mg/L的鄰苯二甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別配制成0.5、1、2、5、10、20mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC分析，外標(biāo)法定量，平行測定3次。以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度膏（X）進(jìn)行線性回歸，回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，4種PAE相關(guān)系數(shù)較高，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表2 PAEs回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and correlation coefficients of PAEs

2.3 膏狀香精中PAEs提取條件的優(yōu)化

根據(jù)表1正交實(shí)驗(yàn)水平表，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算PAEs的平均回收率見表3。

使用SPSS 13.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得到表4～表7，由表4可知，在顯著水平為0.05下，正己烷用量和超聲時(shí)間對(duì)于PAEs的萃取總量有顯著影響，且水浴溫度對(duì)萃取總量影響不顯著，所以各因素的主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞正己烷用量＞水浴溫度。從表5可以看出A2均值最大，同理從表6、表7可以看出B1均值最大（正己烷容易揮發(fā)，溫度較低，萃取液揮發(fā)較少），C3均值最大（超聲時(shí)間過長，萃取效果越好），因此A2B1C3為最佳組合。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal array design

表4 不同提取條件對(duì)萃取總量的方差分析Table 4 Analysis of variance for extraction amount with various extract conditions

表5 正己烷用量對(duì)萃取總量的影響Table 5 Influence of hexane volume on extraction amount

表6 水浴溫度對(duì)萃取總量的影響Table 6 Influence of water temperature on extraction amount

表7 超聲時(shí)間對(duì)萃取總量的影響Table 7 Influence of ultrasonic time on extraction amount

2.4 樣品測定及方法回收率

分別稱取不同膏狀香精0.5g，采用最佳萃取條件：正己烷用量10mL，超聲時(shí)間25min，水浴溫度15℃，進(jìn)行測定，并對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，測定其回收率，并對(duì)每一種樣品重復(fù)測定6次，進(jìn)行分析方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。幾種樣品PAEs含量加標(biāo)回收率測定結(jié)果見表8。

表8 不同膏狀香精PAEs含量及加標(biāo)回收率Table 8 Recovery rate and PAEs content of different cream essence

由表8可見，這兩種樣品PAEs加標(biāo)回收率較為理想，其加標(biāo)回收率在90%～94%之間。樣品測定值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～3.8%，說明本法重復(fù)性較好。另外，在豬骨膏和牛肉膏中均檢出PAEs類物質(zhì)，這表明樣品在生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)運(yùn)過程中可能被PAEs類增塑劑污染，也可能是由于食品包裝容器塑料瓶中PAEs遷移出來的原因。

3 結(jié)論

3.1 以反相液相色譜法測定膏狀香精中PAEs總量的最佳萃取條件：正己烷用量10mL，超聲時(shí)間25min，水浴溫度15℃。

3.2 最佳萃取條件下，豬骨膏、牛肉膏中的加標(biāo)回收率為90%～94%。

3.3 用乙腈-水等梯度洗脫（75∶25），4種PAEs分離較好，在0.5～20mg/L之間，色譜峰面積與4種鄰苯二甲酸酯的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

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Determination of phthalate plasticizers in cream essence by reverse phase liquid chromatography

GAO Xing-hai，CHEN Xiang-lai
（Quality Control Department of Deep Processing，Nanjing Yurun Food Co.，Ltd.，Nanjing 210041，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0076-03

2011-12-29

高興海（1982-），男，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)化學(xué)。