徐赤宇 劉翠杰 吳建華 仇蕓 趙瑾 朱紅梅 溫海

(1.濟(jì)南軍區(qū)總院皮膚科，濟(jì)南 250031;2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科，上海 200433;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003)

新生隱球菌 (C.neoformans)是具有莢膜的擔(dān)子類(lèi)酵母菌，首先通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺部，當(dāng)宿主免疫力低下時(shí)播散入血，最終導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎或腦膜腦炎，有很高的死亡率［1］。近些年來(lái)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使新生隱球菌的致病機(jī)理的研究達(dá)到了一個(gè)更新更深的層次，而基因技術(shù)的關(guān)鍵是分離到純凈、完整的高質(zhì)量生物RNA，對(duì)于進(jìn)行相關(guān)的致病性基因表達(dá)分析研究致關(guān)重要［2］。新生隱球菌具有一般真菌所具有的細(xì)胞壁以外，還有一般真菌所不具有的厚莢膜，厚莢膜具有防御和抵抗吞噬的特性，通常占整個(gè)菌體細(xì)胞體積的70%［3］。

常規(guī)提取核糖核酸的方法是用酶消化細(xì)胞壁和莢膜形成原生質(zhì)體后再破壁抽提，而這個(gè)過(guò)程往往比較繁瑣;在所有的RNA實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNase)的污染和RNA的降解。目前常用的破壁方法包括:熱酸性酚裂解法破壁酶、液氮破壁、酸洗玻璃珠破壁和微波破壁方法［4］以及異硫氰酸胍聯(lián)合玻璃珠法快速抽提DAN和RNA［5］等。因?yàn)榭紤]到酶與細(xì)胞孵育影響RNA的質(zhì)量，熱酸性酚裂解法RNA提取率低以及微波破壁致大量RNA分子斷裂等特點(diǎn)［6-8］，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了4種RNA提取方法進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來(lái)源 新生隱球菌H99(由美國(guó)NIH KwonChung教授惠贈(zèng));新生隱球菌Cap60無(wú)莢膜突變株 (美國(guó) McGurire Veterans Administration Medical Center，Richmonel，Virginia 23249 的 ES.Jacobson教授惠贈(zèng))。

儀器和試劑 ULTROSPEC2100型紫外可見(jiàn)光分光光度儀 (美國(guó) Biochrom Ltd公司);Gel DOC2000凝膠成像分析系統(tǒng) (美國(guó)BD RAD公司);U-3000 Spectrophometer(日本島津公司);Perkoin-Elmer Cetus9600 thermal Cycler(美國(guó) PE公司);TES溶液，含 10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、5%SDS(pH7.5);溶液 D(4 mol/L異硫氰酸胍、25 mmol/L檸檬酸鈉、0.5%Sarcosyl、0.1 mol/Lβ-巰基乙醇);0.45 ～ 0.55 mmol/L Glass beads，Dithiothreitol(DTT)(Singa 公司);RNA 緩沖液，含 10 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、pH7.5;YPD 培養(yǎng)基(2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母抽提物);酸性酚;玻璃珠法抽提緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10 mmol/L EDTA pH8.0，5 mmol/L DTT，100 mmol/L NaCl，1%SDS);Yeast RNA kit提取試劑 (OMEGA公司)。RT-PCR kit(TaKaRa);定量PCR檢測(cè)引物由上海生工合成。羅氏LightCycler 1.5定量PCR儀。

1.2 方法

菌株的培養(yǎng)和裂解 菌株接種到固體沙堡氏培養(yǎng)基斜面上，充分活化3 d后移種一整環(huán)菌株于裝有100 mLYEPD培養(yǎng)基250 mL三角燒瓶中，30℃振蕩培養(yǎng) (200 r/min)16 h，取1 mL菌液離心收集菌體 (5 000 r/min 5 min)，用雙蒸水洗滌2次后重新離心收集菌體 (5 000 r/min 5 min)，每mL菌量約為9×109個(gè)。

莢膜菌株和莢膜缺陷株總RNA提取 嚴(yán)格操作規(guī)程，防止RNA酶的污染。

酸洗玻璃珠法 1 mL YEPD菌體培養(yǎng)液置于1.5 mL管中，10 000 r/min離心2 min收集菌體;用雙蒸水洗滌兩次，同法離心，棄上清液;加入RNA緩沖液重懸，加入200 μL的玻璃珠抽提緩沖液，充分混勻，置于37℃搖床孵育10 min;加入等體積的酸洗玻璃珠酸洗玻璃珠200 μL，高速振蕩1 min，冰浴30 s，重復(fù)5 ～6 次，加入400 μL 不含1%SDS的玻璃珠抽提緩沖液，手搖混勻;12 000 r/min離心2 min，將上清夜轉(zhuǎn)至另一干凈的管中;再加入等體積的酚/氯仿，手搖混勻;12 000 r/min離心10 min;取上清再以等體積的氯仿同法離心1次;加入1/10體積的3 mol/L NaAc(pH5.2)和等體積的異戊醇，來(lái)回顛倒數(shù)次混勻，-20℃放置20 min;室溫下12 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀以70%的冷乙醇洗滌3次，風(fēng)干后加入適量的DEPC水重溶，-20℃貯存。

液氮研磨法 將上述含有9×109菌體細(xì)胞的試劑移入-20℃的50 mL瓷研缽中，加入液氮研磨至糊狀物后移到新試管中［9］。將破壁后的試劑置于37℃搖床孵育10 min;加入氯仿，在旋渦混合器上高速劇烈振蕩2 min。室溫靜置10 min，使得核酸蛋白復(fù)合物充分完全分離;4℃ 13 000 r/min離心10 min，取上層水相到新離心管中加入異丙醇沉淀RNA;75%乙醇洗滌沉淀，干燥;加入20 μL的DEPC處理過(guò)去離子水溶解RNA，-80℃貯存。

異硫氰酸胍一步法 參見(jiàn)文獻(xiàn)［10］方法抽提總RNA。

冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法 收取到的菌體細(xì)胞約9×109，經(jīng)冰冷的無(wú)RNase水重懸離心，棄上清液后各加入200 μL 的直徑0.45～0.55 mm玻璃珠抽提緩沖液，充分混勻，置于37℃搖床孵育10 min;加入等體積的酸洗玻璃珠酸洗玻璃珠200 μL，同時(shí)加入1 mL Yeast RNA kit提取試劑，加入400 μL不含1%SDS的玻璃珠抽提緩沖液，手搖混勻，在旋渦混合器上高速劇烈振蕩2 min。室溫靜置10 min，使得核酸蛋白復(fù)合物充分完全分離;4℃ 13 000 r/min離心10 min，棄上清液。

總RNA定性和定量分析 每種方法重復(fù)5次，將上述抽提的RNA經(jīng)純化后稀釋50倍，RNA的純度分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品A260/A280比值，根據(jù)公式計(jì)算RNA濃度 (μg/mL)=A260×50 μg×稀釋倍數(shù)×樣品總體積，RNA總濃度 (μg/9×109)=20×RNA濃度 (μg/μL)。

總RNA的完整性分析 取5 μL RNA加1 μL溴酚蘭，加入1.2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，電壓110 mV，電流400 mA，緩沖液1×TAE電泳10～15 min，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)RNA進(jìn)行完整性分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0軟件采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行不同方法之間的兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1 墨汁涂片及培養(yǎng)

每種方法破壁后墨汁涂片檢查及培養(yǎng) 鏡檢時(shí)見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，但是發(fā)現(xiàn)少量的未完全破壁的新生隱球菌，培養(yǎng)均未見(jiàn)生長(zhǎng)。

2.2 RNA的定性定量結(jié)果和結(jié)論(見(jiàn)表1)

對(duì)4種方法提取的新生隱球菌菌體細(xì)胞的RNA濃度進(jìn)行SNK檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，酸洗玻璃珠法和液氮研磨法比較的q=2.74(P＞0.05);酸洗玻璃珠法和異硫氰酸胍一步法兩組比較的q=6.85(P＜0.01);酸洗玻璃珠法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法兩組比較的 q=9.65(P＜0.01);液氮研磨法和異硫氰酸胍一步法兩組比較的q=4.02(P＜0.05);液氮研磨法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法兩組比較的q=6.42(P＜0.01);異硫氰酸胍一步法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法兩組比較的 q=6.37(P＜0.01)。結(jié)果表明酸洗玻璃珠法和液氮研磨法提取的RNA量無(wú)差別;酸洗玻璃珠法、液氮研磨法和冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法提取RNA量明顯優(yōu)于異硫氰酸胍一步法;冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit方法最佳。

用t檢驗(yàn)對(duì)用冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法提取的莢膜株和莢膜缺陷株總 RNA濃度(μg/9×109)進(jìn)行比較，得出P＜0.01，說(shuō)明用無(wú)莢膜株提取RNA產(chǎn)量明顯高于有莢膜株，說(shuō)明厚莢膜對(duì)抽提RNA有影響。

2.3RNA完整性分析 (見(jiàn)圖1)

A泳道無(wú)5SrRAN的條帶，B、C、D泳道三條都有，B和C泳道的25S、18S條帶亮度比值約為2，而D泳道的25S、18S條帶亮度比值約為4，說(shuō)明酸洗玻璃珠法和液氮研磨法比異硫氰酸胍一步法提取的RNA完整性好，但是冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法提取的RNA比其他3種方法更好。

2.4 RT-PCR后定量PCR鑒定RNA質(zhì)量

以引物對(duì)新生隱球絲氨酸蛋白酶相關(guān)基因的一段編碼序列，引物由上海生工合成，絲氨酸蛋白酶基因檢測(cè)引物序列如下:F.＇-AACTCCACCACAAACACCA-3 ＇;R.5 ＇-GGAAAGACTCAGTCCCGTAA-3＇。actin 基因檢測(cè)引物序列如下:F.5＇-GCCCTTGCTCCTTCTTCTAT-3 ＇;R.5 ＇-GACGATTGAGGGACCAGACT-3＇。反應(yīng)體積:20 μL;反應(yīng)條件:95℃5 s;55℃ 10 s;72℃ 15 s;76℃讀取熒光值，40個(gè)反應(yīng)循環(huán)。結(jié)果顯示4種方法提取的RNA都可以進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，取相同量RNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法的Ct值最小(見(jiàn)表1)，說(shuō)明這種方法提取的RNA完整性最好，定量PCR檢測(cè)的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。

表1 4種提取方法提取RNA的定量PCR檢測(cè)Tab.1 RT-PCR Detection results in 4 RNA Extraction Methods

3 討 論

在與致病性微生物例如細(xì)菌、病毒及同屬真菌擔(dān)子類(lèi)酵母菌白念珠菌等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域相比較，目前對(duì)抽提新生隱球菌RNA并對(duì)其進(jìn)行致病性調(diào)控基因方面的研究很匱乏。原因之一可能是新生隱球菌單個(gè)致病性酵母細(xì)胞中所含的RNA的量非常少，加之新生隱球菌具有占有其體積70%的厚壁莢膜和細(xì)胞壁的雙重屏障作用，給提取RNA帶來(lái)一定的困難［11］。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外雖然有文獻(xiàn)報(bào)道提取新生隱球RNA，但是方法較為繁瑣和不便捷，RNA提取的關(guān)鍵是破壁，早期的真菌破壁一般采用液氮冷凍研磨，超聲破壁或冷凍干燥研磨，由于劇烈的機(jī)械損傷，而導(dǎo)致大量的RNA分子斷裂［8］。后來(lái)有相繼發(fā)展了傳統(tǒng)的熱酸性酚裂解法破壁酶、液氮破壁、酸洗玻璃珠破壁和微波破壁方法［12］雖然取得了較好的效果，但是都易出現(xiàn)RNase的污染和 RNAD降解。目前利用 Trizol法［13］或Tripure法提取各類(lèi)細(xì)胞RNA較為流行，可是因?yàn)楹辛呀庖汉妥冃砸旱瘸煞?，以及?dān)子菌類(lèi)酵母菌細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，提取過(guò)程中不能充分破壞細(xì)胞壁，提取的總RNA存在不同程度的降解。另外植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，存在有內(nèi)源RNase降解RNA問(wèn)題，許多植物和真菌中含有大量雜質(zhì)如多糖、多酚等，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來(lái)去除多糖、多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。本課題組總結(jié)上述方法的不足，加以改進(jìn)，首先利用冷酸洗玻璃珠機(jī)械振蕩充分破壞新生隱球菌雙重屏障，破壞細(xì)胞壁的二硫酸鍵獲得較高的原生質(zhì)體，使得RNA全部釋放出來(lái)，再使用商品化專(zhuān)門(mén)針對(duì)酵母菌Yeast RNA kit進(jìn)行常規(guī)的物理分離，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離，提取步驟簡(jiǎn)便、快捷，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程1h內(nèi)即可完成，提取的RNA產(chǎn)量、純度、完整性完全可滿足高質(zhì)量分子生物學(xué)研究需要。1×109CFU/mL菌體所獲RNA量足夠做PT-PCR之用;玻璃珠經(jīng)反復(fù)洗滌可以重復(fù)利用，亦節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。在上述幾種抽提方法中，對(duì)所用菌株均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為宜，菌齡老化的細(xì)胞嚴(yán)重影響RNA的得率。

圖1 RNA電泳結(jié)果:A.異硫氰酸胍一步法，B.酸洗玻璃珠法，C.液氮研磨法，D.冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法 圖2 Real-time PCR結(jié)果:A.異硫氰酸胍一步法，B.酸洗玻璃珠法，C.液氮研磨法，D.冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法(β-actin組)，E.異硫氰酸胍一步法，F(xiàn).酸洗玻璃珠法，G.液氮研磨法，H.冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法 (絲氨酸蛋白酶組)Fig.1 RNA Electrophoresis Results:A.Single-step by isothiocyanate guanidine，B.Glass bead method by acid washing，C.Liquid nitrogen grinding，D.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit Fig.2 Results of Real-time PCR:A.Single-step by isothiocyanate guanidine，B.Glass bead method by acid washing，C.Liquid nitrogen grinding，D.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit(Beta-actin group)，E.Single-step by isothiocyanate guanidine，F(xiàn).Glass bead method by acid washing，G.Liquid nitrogen grinding，H.Glass bead method by cold acid washing combined with Yeast RNA Kit(Serine Protease group)

實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)破壁提取新生隱球菌RNA的方法以冷酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法最好，酸洗玻璃珠法和液氮研磨法次之，而異硫氰酸胍一步法很少。說(shuō)明玻璃珠通過(guò)延長(zhǎng)破壁振蕩時(shí)間可以充分提高破壞酵母相真菌細(xì)胞壁效率，其操作簡(jiǎn)便，需時(shí)短于其他破壁方法。總之，提取RNA的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的、要求、實(shí)驗(yàn)條件、組織性質(zhì)和RNA完整性的要求選擇破壁和提取方法，根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酸洗玻璃珠聯(lián)合Yeast RNA kit法是提取致病性酵母菌新生隱球菌RNA的有效方法，既可以減少樣品間交叉污染又可以減少靶RNA丟失?？梢赃m用于大規(guī)模、高產(chǎn)量、高質(zhì)量地抽提隱球菌RNA和用于RTPCR分析之用。

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