曾 立， 向 榮， 尹文清， 歐陽恩鴻， 曾 燕

(1.邵陽醫(yī)學高等專科學校藥學系，湖南邵陽 422000;2.廣西師范大學藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室，廣西桂林 541004)

定心藤Mappianthus iodoies系茶茱萸科Icacinaceae定心藤屬Mappianthus植物，為瑤醫(yī)常用藥材“十八鉆”之一［1］?，庒t(yī)認為“鉆”類藥物性能強勁鉆透、通達經絡、透利關節(jié)，多為行氣止痛、散瘀消腫藥，是瑤族傳統(tǒng)治癌“打藥”［2］。因此，瑤醫(yī)常用其藤莖來除濕、消腫和消炎，還用來治療毒蛇咬傷及黃疸。作者曾對定心藤中化學成分進行研究［1］，不曾得到確切的相對應活性物質，而定心藤中揮發(fā)油的提取和組分分析，國內外還尚未見報道。

通常揮發(fā)油一般具有驅風和局部刺激作用，另外還有廣泛的生物活性，臨床上主要用于止咳、平喘、祛痰、發(fā)汗、解表、鎮(zhèn)痛及抗菌消炎等功效［3］。這些都與定心藤的臨床應用很相似，為了進一步深入認識定心藤的內在化學成分，本研究擬通過正交試驗探討定心藤中揮發(fā)油超臨界CO2的最佳提取工藝條件，并采用GC/MS聯用技術對揮發(fā)油中化學成分進行定性分析，采用峰面積歸一化法計算各成分相對含有量。該實驗結果為瑤族醫(yī)藥定心藤的進一步開發(fā)研究提供科學依據。

1 材料和儀器

石油醚 (60～90℃)，苯，KOH，甲醇 (以上試劑均為分析純級，廣東汕頭市西隴化工廠);所用水為二次蒸餾水;CO2為食品級 (≥99%);定心藤購自邵陽市中心大藥房，經由楊林老師鑒定為茶茱萸科定心藤屬植物定心藤Mappianthus iodoies，標本存放于邵陽醫(yī)學高等專科學校藥學系植物標本室。

HA 130-50-01型超臨界萃取裝置 (江蘇南通華安科研儀器有限公司);Agilent6890-5973氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司);JA1003N型電子天平 (上海江岳電子科技有限公司);JB/T5520-91型電熱恒溫干燥箱 (上海躍進醫(yī)療器械廠)。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提取［4］準確稱取粉碎后的定心藤干燥藤莖350 g裝入料筒，放入萃取釜內，打開冷循環(huán)制冷氣閥，設置萃取釜分離Ⅰ、分離Ⅱ的溫度，當制冷設備停止工作時，打開高壓泵，并打開相應閥門保持通路狀態(tài)，通過流量計調節(jié)CO2的流量;保持恒溫恒壓循環(huán)并維持適當時間，萃取完畢，打開分離釜排料閥，收集提取物。

2.2 正交試驗設計 參閱相關資料，以定心藤揮發(fā)油的收率為考察指標，選用萃取壓力 (A)、萃取溫度 (B)、萃取時間 (C)和CO2流量 (D)4個因素3個水平進行正交試驗［5］(見表1)，每個試驗號平行做3次實驗，得出定心藤揮發(fā)性成分的最佳提取工藝條件。

表1 因素水平

2.3 脂肪酸甲酯制備 采用酯交換法［6］:稱取20 mg萃取物，置入10 mL試管中，加石油醚-苯 (1∶1)溶液2 mL，振蕩溶解，再加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液2.0 mL，劇烈振蕩1 min，放入60℃水浴鍋靜置，試管取出后再加入水至刻度，取上層清液進行測定。

2.4 GC/MS測定條件［7］氣相色譜條件:Agilent6890-5973氣相色譜-質譜聯用儀，HP-5msi毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm);進樣口溫度250℃;升溫程序:設置初溫40℃保持4 min，以6℃/min速度升溫到200℃保持5 min，以8℃/min速度升溫到260℃保持20 min;載氣為99.999%高純氦氣，體積流量1 μL/min，進樣量1 μL，不分流進樣 。

質譜條件:EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，柱前壓9.8 psi(1 psi=6.895 kPa)，掃描質量范圍(m/z):35～550。

3 結果與討論

3.1 定心藤超臨界CO2萃取正交試驗結果 根據表2的L9(34)正交試驗分析可知，影響超臨界CO2流體萃取定心藤揮發(fā)性成分的主次因素為:A＞D＞C＞B。B因素為不顯著因素，綜合分析，超臨界CO2流體萃取定心藤中揮發(fā)性成分的最佳工藝為:A3B2C3D3，即萃取壓力45 MPa，萃取溫度40℃，萃取時間4 h，萃取體積流量30 L/h，在此條件下揮發(fā)性成分的3次平均收率能達到1.217%。

表2 L9(34)正交試驗結果

3.2 氣質聯用結果 利用氣相色譜-質譜聯機聯用法對定心藤超臨界CO2萃取物進行分離和結構鑒定。對總離子圖中的各色譜峰對應的質譜圖經聯用儀的計算機N ISTO5譜庫進行定性檢測，從定心藤揮發(fā)油中分離出85個峰。依據相似度的概率 (本研究只討論匹配度大于90%的物質)，結合人工譜圖解析，并查閱相關的文獻［8］，確認了32種化合物，結果見表3。各組分的相對質量分數是根據總離子流圖由計算機采用峰面積歸一化法計算而得。

從表3可知，超臨界CO2萃取所得定心藤揮發(fā)油中主要是脂肪烴、酯類、脂肪酸等類型化合物，已鑒定成分占揮發(fā)性成分總量的55.04%，其中質量分數最高的組分是棕櫚酸甲酯，亞油酸甲酯，油酸甲酯，角鯊烯等。

3.3 討論

本實驗采用超臨界CO2萃取法具有環(huán)境友好、操作溫度低、有效成分不易破壞等優(yōu)點。在萃取過程中排除了一些化學成分遇氧易氧化或見光反應的可能性，能真實、全面地反映定心藤中揮發(fā)性化學組分。

表3 定心藤中揮發(fā)油中化學成分

醫(yī)學研究表明，不飽和脂肪酸對人體具有重要的平衡調節(jié)作用，是不可缺少的物質，在降血脂、抗腫瘤、營養(yǎng)和免疫調節(jié)等方面起重要作用［9］。其中棕櫚酸與降低血清膽固醇、抑制血小板聚集的藥理作用是密切相關的［10］;而亞油酸具有防癌抗癌、增強機體免疫能力、降低膽固醇和逆轉動脈粥樣硬化的作用［11］。角鯊烯［12］是一種重要的生物活性物質，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗心血管疾病等功效。

瑤藥是中華民族特色醫(yī)藥的重要組成部分。由于各種原因，目前對于瑤醫(yī)藥的研究還局限于較低水平。本研究結果顯示，定心藤超臨界CO2提取揮發(fā)油中具有抗腫瘤活性成分，而在本研究的后續(xù)研究中，我們發(fā)現定心藤超臨界CO2提取揮發(fā)油具有清除自由基的功能［13］，這些研究結果為定心藤做為瑤族傳統(tǒng)治癌“打藥”［14］提供了一定的科學依據，但仍有許多問題需要進一步研究。比如定心藤其中的活性物質是否是角鯊烯、棕櫚酸、亞油酸其中之一或者是協(xié)同作用有待進一步的藥理實驗研究。

［1］曾 立，尹文清.定心藤中酚性成分的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(4):838-840.

［2］戴 斌，李釗東，邱翠嫦，等.“虎牛鉆風”類傳統(tǒng)瑤藥的調查研究［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，1998，31(2):28-31.

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［6］韓 娜，趙建邦，宋平順.萊菔子脂溶性成分的GC-MS分析［J］.中國現代應用藥學，2011，28(1):74-76.

［7］李 葉，尹文清，段少卿.瓜馥木揮發(fā)油GC—MS分析［J］.糧食與油脂，2010(6):17-19.

［8］叢浦珠.天然有機質譜學［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2008.

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［11］納 智.滇南紅厚殼種子油的脂肪酸成分［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2005，13(6):505-506.

［12］官 波，鄭文誠.角鯊烯提取、純化及其應用［J］.糧食與油脂，2010(2):44-46.

［13］曾 立，尹文清，朱 琪，等.定心藤揮發(fā)油抗氧化活性研究［J］.廣東農業(yè)科學，2011，38(18):80-83.

［14］龐聲航，余勝民，黃琳蕓，等.廣西20種傳統(tǒng)瑤藥抗腫瘤篩選研究［J］.廣西中醫(yī)藥，2006，29(4):53-57.