周濤，陳遠(yuǎn)學(xué)，鄒依霖，李克祥，汪鵬，蔣攀，徐開未

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川雅安625014)

四川是我國(guó)南方大豆的主產(chǎn)區(qū)，但四川大豆需求量遠(yuǎn)大于產(chǎn)量，年消耗量在200萬(wàn)噸左右，而年產(chǎn)量?jī)H有50萬(wàn)噸，缺口150萬(wàn)噸以上［1］。近年來(lái)“小麥/玉米/大豆”旱作新三熟種植模式在四川山地丘陵區(qū)得到大力推廣，四川大豆種植面積隨之大幅度增加［2］。作為主要豆科作物，大豆有較強(qiáng)的共生固氮能力。豆科植物與根瘤菌共生固氮量占全球每年生物固氮量的70%，高效根瘤菌劑的使用可以減少化學(xué)氮肥的施用量，節(jié)約生產(chǎn)成本，降低化學(xué)氮肥過量施用造成的環(huán)境污染，且能提高大豆產(chǎn)量與品質(zhì)［3］。土壤中75%以上的土著根瘤菌是低效或無(wú)效菌株，且競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力強(qiáng)，是高效固氮根瘤菌發(fā)揮生物固氮作用的重要限制因素［3－4］。優(yōu)良菌株的篩選一般以菌株的固氮能力、與品種的匹配性和與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并還需在種植區(qū)進(jìn)行田間試驗(yàn)確證后方可在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用［3－6］。而至目前，四川大豆根瘤菌與大豆主栽品種的匹配性，高效菌株的篩選及田間應(yīng)用的研究還鮮見報(bào)道。為此，本研究利用分離自四川33個(gè)市縣區(qū)35個(gè)采樣點(diǎn)的70株大豆根瘤菌株，采用無(wú)氮水培初篩，盆栽、田間試驗(yàn)復(fù)篩，通過比較供試根瘤菌的結(jié)瘤能力、共生固氮能力，以及田間小區(qū)試驗(yàn)的大豆產(chǎn)量為主要指標(biāo)，篩選與四川主栽大豆品種“貢選1號(hào)”匹配性好的菌株，為該地區(qū)高效大豆根瘤菌劑的研制與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆品種為“貢選1號(hào)”，由四川省自貢市農(nóng)科所選育。供試菌種是從采集自四川省33個(gè)市縣35個(gè)采樣點(diǎn)的根瘤中分離出的70個(gè)根瘤菌株，其基本狀況見表1。

供試土壤：盆栽試驗(yàn)用土為采自四川雅安草壩鎮(zhèn)青衣江的潮濕雛形土(潮土)，基本養(yǎng)分狀況：pH 5.9，有機(jī)質(zhì)含量13.3 g/kg，全氮0.30 g/kg，堿解氮70.2 mg/kg，有效磷 30.2 mg/kg，速效鉀 26.9 mg/kg。大田試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，土壤為紫色濕潤(rùn)雛形土(紫色大土)，其pH 6.7，有機(jī)質(zhì)含量35.4 g/kg、全氮0.70 g/kg、堿解氮95.2 mg/kg、有效磷 31.2 mg/kg、速效鉀 54.4 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 第一次水培篩選 第一次水培實(shí)驗(yàn)：將從四川21個(gè)市縣區(qū)23個(gè)采樣點(diǎn)分離純化獲得的52個(gè)大豆根瘤菌株(見表1)，于2008年12月3日至2009年1月6日用無(wú)氮水培法進(jìn)行大豆回接實(shí)驗(yàn)。對(duì)照不接種，每個(gè)處理重復(fù)3次。催芽和播種方法按參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。溫室培養(yǎng)35 d后收獲，測(cè)定植株鮮重、干重和總瘤數(shù)。

1.2.2 盆栽復(fù)篩 2009年5月12日至2009年8月2日，用第一次水培實(shí)驗(yàn)篩選到的6個(gè)高效菌株(S8，S22，S36，S46，S55，S65)分別制成 6 種根瘤菌劑，菌劑的生產(chǎn)及質(zhì)量檢測(cè)方法同參考文獻(xiàn)［8］，貯存48 d(活菌數(shù)均在5億/g以上)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。每盆裝土6 kg，根瘤菌劑采用拌種法，用量為1 g/盆，播種深度2 cm左右，每盆播種4粒，定苗2株，以不接種為對(duì)照，共7個(gè)處理，重復(fù)3次。盛花期(生育期83 d)測(cè)定植株鮮重、干重、株高、總瘤數(shù)，方法同參考文獻(xiàn)［8］。

1.2.3 第二次水培篩選 以從四川另外12個(gè)市縣區(qū)12個(gè)采樣點(diǎn)分離的18個(gè)大豆根瘤菌菌株(見表1)為供試菌，以盆栽復(fù)篩出的2個(gè)高效大豆根瘤菌株(S8，S36)作陽(yáng)性對(duì)照，以不接種CK作陰性對(duì)照，于2010年4月29日至2010年6月16日進(jìn)行第二次水培回接篩選實(shí)驗(yàn)。溫室培養(yǎng)49 d收獲，測(cè)定植株鮮重、干重和總瘤數(shù)。

1.2.4 大田試驗(yàn) 盆栽試驗(yàn)和第二次水培實(shí)驗(yàn)共篩選到5株與四川主栽大豆品種“貢選1號(hào)”結(jié)瘤能力和共生固氮能力均強(qiáng)的大豆根瘤菌株(S8，S149，S150，S151，S152)，將這 5 個(gè)菌株制成 5 種根瘤菌劑，方法同1.2.2，于2010年6月26日至2010年11月6日進(jìn)行田間隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)根瘤菌劑處理和1個(gè)不接種(對(duì)照)處理，小區(qū)面積2 m2，每個(gè)處理重復(fù)3次。根瘤菌劑采用拌種法，每小區(qū)用量2.5 g，在貯存期10 d(活菌數(shù)均在5億/g以上)進(jìn)行。窩距33 cm、行距35 cm，每窩播6粒，定苗3株。盛花期(生育期 80 d)測(cè)定植株鮮重、干重、株高、總瘤數(shù)、平均單瘤重;收獲期(生育期134 d)測(cè)定飽莢數(shù)、癟莢數(shù)、植株干重(收獲時(shí)植株葉子基本掉完，干重僅為植株莖莢干重)、豆粒產(chǎn)量、飽癟比(飽癟比=飽莢數(shù)/癟莢數(shù))，地上部植株樣品用 H2SO4－H2O2消煮聯(lián)合測(cè)定氮、磷、鉀含量［9］。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 供試菌株基本狀況Table 1 Rhizobia strains used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 第一次水培篩選結(jié)果分析

第一次無(wú)氮水培初篩結(jié)果表明，52個(gè)根瘤菌處理全部結(jié)瘤，結(jié)瘤數(shù)為0.7～30.7個(gè)/株，CK未結(jié)瘤;植株干重高于 CK(0.47 g/株)的有31個(gè)(占59.6%)菌株處理，但顯著或極顯著高于CK的僅有S8、S22、S36、S46、S55、S65 6 個(gè)菌株處理，其植株干重為 0.65～0.70 g/株，結(jié)瘤數(shù)為 17.3～28.3個(gè)/株;另有2株(S16、S26)的植株鮮重顯著低于CK，其結(jié)瘤數(shù)為1.3～2.7個(gè)/株?？梢?，在本次水培實(shí)驗(yàn)中，植株干重高的處理其結(jié)瘤量中等，結(jié)瘤能力過弱或過強(qiáng)的菌株表現(xiàn)低效或無(wú)效，可能是結(jié)瘤能力過弱的菌株，即使固氮能力強(qiáng)但固氮量也有限;相關(guān)研究表明，絕大多數(shù)土著根瘤菌形成的根瘤的固氮效率不高，為大豆生長(zhǎng)提供的氮素營(yíng)養(yǎng)有限［5，6］，若結(jié)瘤能力過強(qiáng)，消耗宿主營(yíng)養(yǎng)多，故表現(xiàn)為低效或無(wú)效。在第一批供試的52株根瘤菌中，僅有11.5%是高效菌株，大多數(shù)(88.5%)是低效、無(wú)效菌株。為此初步篩選出與“貢選1號(hào)”共生匹配性好的大豆根瘤菌為 S8、S22、S36、S46、S55、S65，這6個(gè)菌株作為后續(xù)盆栽復(fù)篩試驗(yàn)的供試菌株。

2.2 盆栽復(fù)篩結(jié)果分析

2.2.1 接種根瘤菌對(duì)大豆結(jié)瘤的影響 將第一次水培篩選獲得的6個(gè)高效大豆根瘤菌株(S8、S22、S36、S46、S55、S65)接種“貢選 1 號(hào)”進(jìn)行土壤盆栽試驗(yàn)，植株結(jié)瘤情況見表2，除S55外，其他5個(gè)菌株(S8、S22、S36、S46、S65)處理的結(jié)瘤數(shù)均高于CK，其中S8和S36處理的根瘤數(shù)顯著、極顯著高于CK，分別比 CK增加86.6%和72.2%。說(shuō)明 S8、S36結(jié)瘤能力強(qiáng)，或可促進(jìn)土著根瘤菌結(jié)瘤。

2.2.2 接種根瘤菌對(duì)大豆植株生長(zhǎng)的影響 從表2知，S8、S36處理的植株鮮重、干重均明顯高于CK，S36植株鮮重比CK顯著增加32.1%;S46、S65的植株干重、鮮重均低于CK，但差異不顯著。綜合結(jié)瘤能力和共生固氮能力，S8、S36結(jié)瘤能力最強(qiáng)，且其植株鮮重、干重比CK的增加量最大，說(shuō)明在有土著根瘤菌存在的情況下，S8、S36與“貢選1號(hào)”的共生匹配性最好。

表2 接種根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響(盆栽試驗(yàn))Table 2 Effect of rhizobia inoculation on soybean growth(pot experiment)

2.3 第二次水培篩選結(jié)果與分析

將第二次分離純化得到的18株根瘤菌(表1)，以盆栽復(fù)篩得到的S8、S36和不接種CK分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，用水培法回接“貢選1號(hào)”，從中篩選高效菌株。18個(gè)菌株全部結(jié)瘤，植株結(jié)瘤數(shù)為26.3～68.0個(gè)/株。所有菌株處理的植株干重均高于CK，其中顯著或極顯著高于CK(0.91 g/株)的有6個(gè)菌株(S149、S150、S151、S152、S159、S163)處理，其植株干重為 1.15～1.36 g/株。且 S149、S150、S151、S152 4個(gè)處理的植株干重高于陽(yáng)性對(duì)照S8(1.28 g/株)、S36(1.23 g/株)，但差異未達(dá)顯著水平;其植株結(jié)瘤數(shù)為30.0～39.0個(gè)/株。植株干重和單瘤重的相關(guān)系數(shù)(r=0.381＊＊)達(dá)極顯著水平，可見單瘤重對(duì)植株的固氮能力影響較大。

兩次水培實(shí)驗(yàn)均表明結(jié)瘤數(shù)太少或太多的菌株是中、低效菌株，而共生固氮效果顯著的菌株其結(jié)瘤量中等。從第二次水培實(shí)驗(yàn)中篩選到的 S152、S151、S150、S149 4個(gè)菌株是與“貢選1號(hào)”大豆品種共生匹配性好的菌株。

2.4 田間試驗(yàn)結(jié)果分析

綜合前期篩選結(jié)果，選擇5個(gè)菌株S152、S151、S150、S149、S8進(jìn)行田間隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)作進(jìn)一步篩選應(yīng)用。

2.4.1 接種根瘤菌對(duì)大豆植株生長(zhǎng)的影響 接種不同根瘤菌對(duì)盛花期大豆植株生長(zhǎng)影響較大。接種S152、S151、S150的植株株高、鮮重和干重均高于CK，其干重分別比 CK增加11.8%、8.1%、6.6%，但與CK的差異未達(dá)顯著水平。S8和S149的盛花期大豆的株高、鮮重和干重均低于CK。5個(gè)接種處理的大豆根瘤數(shù)均未高于CK(表3)。但從表3可以看出，根瘤菌處理的收獲期植株干重均高于CK，且S152最高。植株莖氮、磷、鉀含量均高于CK。接種S152的植株氮、磷、鉀含量最高，比CK分別增加26.9%、22.2%、38.6%。說(shuō)明接種根瘤菌不僅能促進(jìn)寄主植物對(duì)氮的吸收，還能促進(jìn)對(duì)磷、鉀的吸收，這與徐開未等［8，10］的研究結(jié)果一致。

2.4.2 接種根瘤菌對(duì)大豆產(chǎn)量的影響 接種不同根瘤菌對(duì)大豆產(chǎn)量的影響存在顯著差異。表4顯示，除S151外，其他菌劑處理的大豆產(chǎn)量均高于CK。S152、S150處理的大豆產(chǎn)量比CK高33.5%、18.5%，達(dá)顯著水平，且顯著高于S8、S149、S151處理。接種處理的植株結(jié)莢數(shù)均高于CK，但差異不顯著;S152、S150以結(jié)二粒莢為主，S152飽莢數(shù)極顯著高于CK，癟莢數(shù)低于其他5個(gè)處理，S152、S150飽癟比(飽莢數(shù)和癟莢數(shù)之比)分別為3.79、3.05，明顯高于其他接種菌株和CK;以結(jié)單粒莢為主的S151、S149結(jié)莢量最大，飽莢數(shù)、癟莢數(shù)均明顯高于CK，但產(chǎn)量與CK間的差異不顯著。飽癟比與產(chǎn)量相關(guān)性達(dá)顯著水平(r=0.548*)。可見，高效根瘤菌的增產(chǎn)主要是通過增加大豆的二粒飽莢數(shù)，提高飽莢率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

表3 接種根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)及莖氮、磷、鉀含量的影響Table 3 Effects of rhizobia inoculation on soybean growth and total N，P and K contents in plant stems

表4 接種根瘤菌對(duì)收獲期大豆產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of rhizobia inoculation on yield of the soybean at the harvest stage

綜上，從接種根瘤菌對(duì)供試大豆品種的生長(zhǎng)性狀及產(chǎn)量的影響來(lái)看，S152和S150是與四川主栽大豆品種“貢選1號(hào)”和供試土壤匹配性好的菌株，且S152最佳。

3 討論

高效根瘤菌的篩選工作繁瑣又復(fù)雜。首先用大量菌株針對(duì)作物品種以無(wú)菌基質(zhì)(無(wú)氮水培或蛭石)在溫室中篩選一批共生效果高的菌株;然后以種植區(qū)土壤為基質(zhì)，篩選出與土著菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力強(qiáng)的菌株;最后在種植地區(qū)進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)確證后方能推廣應(yīng)用接種［3］。土壤理化性質(zhì)、肥力水平、土著根瘤菌的數(shù)量等因素都直接影響根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力［11－12］，氮素水平較低的土壤能夠提高接種劑的成功率［13］。本研究正是應(yīng)用無(wú)氮水培、盆栽和田間試驗(yàn)篩選菌株，而在不同試驗(yàn)條件下有的菌株共生有效性表現(xiàn)不一致。如S8在兩次水培實(shí)驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中均表現(xiàn)較好，說(shuō)明S8與供試大豆品種的共生匹配性好，但在田間試驗(yàn)中對(duì)大豆的增產(chǎn)效果不明顯，可能與土著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力有關(guān)，可見，高效菌株的篩選必須要在種植區(qū)進(jìn)行田間試驗(yàn)確證后方能推廣應(yīng)用。在肥力水平相差較大的不同土壤中可能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力差別較大。在第二次水培實(shí)驗(yàn)中，結(jié)瘤能力較強(qiáng)且植株干重極顯著高于對(duì)照的5個(gè)菌株，其植株干重表現(xiàn)為S151＞S152＞S149＞S150=S8＞CK，說(shuō)明這些菌株與四川大豆主栽品種“貢選1號(hào)”具有良好的親和性，但在大田試驗(yàn)中這5個(gè)菌株共生固氮能力有明顯的差異，S152、S150的產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，而S151的產(chǎn)量還略低于對(duì)照，可能是因?yàn)榕c供試大豆共生匹配性好的這5個(gè)菌株中，S152和S150比供試土壤土著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)，而S151最差，這需要后續(xù)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤試驗(yàn)加以證實(shí)。菌株的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力是接種成功的關(guān)鍵［3，5，11］，為此，本研究也將繼續(xù)對(duì)田間試驗(yàn)篩選到的高效菌株進(jìn)行分子標(biāo)記用以檢測(cè)其占瘤率，考察接種菌與四川大豆種植土壤的適應(yīng)性和與土著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，以期獲得適應(yīng)四川大豆種植區(qū)土壤、與四川主栽大豆品種“貢選1號(hào)”匹配性最佳的高效菌株。

在考察根瘤菌與宿主的共生固氮效果時(shí)，經(jīng)常用盛花期植株地上部分鮮重、干重等指標(biāo)評(píng)價(jià)菌株的共生有效性［8，10］。本試驗(yàn)所得高效菌株在水培實(shí)驗(yàn)、盆栽試驗(yàn)中盛花期植株干重、鮮重均比對(duì)照明顯增加;大田試驗(yàn)中盛花期植株鮮重、干重與對(duì)照相當(dāng)或略有增加，可能是因?yàn)樵囼?yàn)田在種植雙胞蘑菇后土壤較肥沃，高效根瘤菌的共生固氮效果在生長(zhǎng)前期還沒顯著體現(xiàn)出來(lái)。而到生殖生長(zhǎng)期，高效菌株的固氮效率得以顯著體現(xiàn)：接種S152和S150的大豆產(chǎn)量均顯著高于對(duì)照和其他三個(gè)接種菌株S151、S149、S8。眾所周知，根瘤菌的共生固氮能力，在含氮量越低的土壤中表現(xiàn)得越明顯，而本研究篩選到的S152和S150兩個(gè)菌株在較肥沃土壤中接種“貢選1號(hào)”，其產(chǎn)量仍與對(duì)照的差異達(dá)顯著水平，說(shuō)明這兩個(gè)菌株在四川大豆生產(chǎn)中有良好的應(yīng)用前景。而S151、S149、S8雖在水培試驗(yàn)中表現(xiàn)為高效菌株，但在田間試驗(yàn)中表現(xiàn)無(wú)效或低效，可能也與該土壤的肥力水平和土著根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力的影響有關(guān)。

植株氮、磷、鉀的吸收是產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，大豆是需鉀量較高的作物［14］。接種根瘤菌能為植株提供氮素，同時(shí)促進(jìn)磷、鉀的吸收。焦如珍等［15］認(rèn)為根瘤菌有溶磷能力，且同一屬種的根瘤菌不同菌株之間溶磷能力相差巨大。張慧等［16］用根瘤菌接種大葉相思幼苗的研究表明，6個(gè)供試菌株的溶鉀效果均較明顯，但僅有1個(gè)菌株有較好的溶磷能力。而本研究中，兩高效菌株S152、S150接種的植株氮、磷、鉀含量明顯高于對(duì)照，且全鉀含量的增幅最大，分別比對(duì)照增加38.5%、40.7%，而田間試驗(yàn)表現(xiàn)無(wú)效的菌株S151接種植株的含鉀量還略低于對(duì)照，可能是這兩個(gè)高效根瘤菌(S152、S150)有一定的溶鉀溶磷能力，且高效菌株的共生固氮與鉀的協(xié)同作用好。這兩株高效菌的溶鉀溶磷能力有待進(jìn)一步研究和開發(fā)利用。

紫色土是四川最重要的旱耕地，潮土也是較重要的旱耕地之一［17］，四川大豆種植區(qū)土壤主要是紫色土和潮土等，若能篩選到與這兩種未滅菌的自然土壤適應(yīng)性均好的高效菌株，在四川應(yīng)有較好的應(yīng)用潛力。本研究從四川33個(gè)市縣35個(gè)采樣點(diǎn)分離獲得的70個(gè)大豆根瘤菌株中通過無(wú)氮水培、盆栽(潮土)和大田小區(qū)試驗(yàn)(紫色土)篩選出了與四川大豆主栽品種“貢選1號(hào)”匹配性最佳的菌株S152和S150，這為四川大豆高效根瘤菌的進(jìn)一步篩選鑒定，高效根瘤菌劑的研制與應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)，具有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

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