劉大會(huì)，朱端衛(wèi)，郭蘭萍，劉 偉，左智天，金 航，楊 雁

(1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北武漢430070;2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南昆明650231;3中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700)

菊花為菊科植物菊(Chrysanthemum morifoliumRamat．)的干燥頭狀花序，是我國(guó)傳統(tǒng)常用大宗中藥材，其主要成分為綠原酸、黃酮、糖、氨基酸及礦質(zhì)元素等，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，且還為藥食同源的物品，被廣泛用于保健茶飲和食品。綠原酸和黃酮等酚類(lèi)物質(zhì)是植物體莽草酸代謝途徑生成的次生代謝產(chǎn)物，其對(duì)提高植物體自身保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)能力起著重要的作用［1－3］，光照、臭氧、溫度、水分脅迫和傷害等多種環(huán)境因素的刺激都會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)［4－6］。在藥菊次生代謝過(guò)程中，植株體內(nèi)的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化下解氨生成反式肉桂酸，是生成黃酮和綠原酸等次生物質(zhì)的莽草酸代謝途徑的第一步反應(yīng)，即關(guān)鍵反應(yīng)步驟，這一過(guò)程對(duì)菊花藥用品質(zhì)舉足輕重。近年來(lái)，施用氮肥對(duì)植物中酚類(lèi)成分合成代謝的調(diào)控也日益受到人們的關(guān)注［7－9］。施用氮肥對(duì)藥用菊花生長(zhǎng)、產(chǎn)量和養(yǎng)分累積等也有顯著影響［10－11］，但關(guān)于氮肥用量對(duì)藥菊綠原酸、黃酮、可溶性糖和氨基酸等活性成分及其植株相關(guān)生理指標(biāo)影響的研究報(bào)道較少。為此，本文采用盆栽試驗(yàn)方法，研究了氮肥用量對(duì)藥用菊花活性成分累積及其葉綠素含量、PAL活性和礦質(zhì)元素含量的影響及其作用機(jī)理，以期為藥菊規(guī)范化栽培的合理施氮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2005年6月至12月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素研究中心盆栽試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。供試藥菊種苗引自湖北麻城市福田河鎮(zhèn)藥菊種植基地，栽培品種為福田河白菊(杭菊)，適合在微酸性土壤上種植。為確保肥效區(qū)分，供試土壤采自武漢獅子山黃棕壤的底土，基本理化性狀為：pH 5.92、有機(jī)質(zhì)含量0.26%、堿解氮21.4 mg/kg、速效磷2.6 mg/kg、速效鉀60.7 mg/kg。

盆栽試驗(yàn)每盆裝土10.0 kg(適當(dāng)添加石英砂，以改善通氣狀況)，設(shè)置5個(gè)氮肥用量，分別為N 0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 g/kg 土，分別用 N1、N2、N3、N4和 N5表示，以硫酸銨作肥源，各處理氮肥分3次施入，底施1/2，剩余氮肥平均分成兩份，分別于8月16日和9月20日追施;各處理均基施P2O50.20 g/kg土和 K2O 0.30 g/kg土，以 Ca(H2PO4)2、K2SO4作肥源;另每盆基施10 g白云石以調(diào)節(jié)土壤pH值和補(bǔ)充鈣、鎂營(yíng)養(yǎng);同時(shí)，每盆基施10 mL阿農(nóng)微量元素混合液以補(bǔ)充土壤微量營(yíng)養(yǎng)元素。每處理4次重復(fù)，每盆定植1株藥菊扦插苗，定植時(shí)間為6月15日，按照常規(guī)進(jìn)行管理。菊花采收期為當(dāng)年11月1日～12月15日。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

采用SPAD-502葉綠素計(jì)測(cè)定藥菊葉片葉綠素含量。在藥菊生長(zhǎng)期，每隔一段時(shí)間在植株上隨機(jī)抽取6片上部葉片(每個(gè)枝條從上向下數(shù)第5～6片葉)測(cè)定其葉綠素值，取平均值作為植株葉綠素相對(duì)含量。

參照 Lister等［12］和李合生［13］的方法測(cè)定花、葉樣品的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。分別于11月5日、11月17日和12月3日分三次，從各處理植株枝條頂部上隨機(jī)采取8朵花瓣微開(kāi)的鮮花，以及植株枝條上部的第3、4片葉，用于測(cè)定花及葉片中的PAL活性。

在藥菊蕾期調(diào)查植株的分枝數(shù)和株高;在花期，當(dāng)花朵的舌狀花全白、管狀花50%左右展開(kāi)時(shí)開(kāi)始采樣，并按照菊花質(zhì)量先后采收一水花(11月15日以前采收，對(duì)應(yīng)早期)、二水花(11月15～25日采收，對(duì)應(yīng)中期)和三水花(11月25日以后采收，對(duì)應(yīng)末期)。在稱(chēng)量鮮花產(chǎn)量后及時(shí)將花用微波殺青，于55℃以下烘至全干稱(chēng)重。將制備好的菊花粉碎制樣，過(guò)篩，保存待測(cè)。采用 HPLC法測(cè)定綠原酸［14］，鋁鹽比色法測(cè)定總黃酮［14］，用蒽酮比色法測(cè)定可溶性總糖，用茚三酮比色法測(cè)定可溶性總氨基酸。

將活性成分的含量乘以各期花干物質(zhì)量并累加得到活性成分的累積量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel(2003)和SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥用量對(duì)藥菊植株生長(zhǎng)和菊花產(chǎn)量的影響

氮肥用量較低時(shí)(N1～N3)，藥菊生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，植株低矮，分枝少;氮肥用量增加，植株株高和分枝數(shù)大幅增加，見(jiàn)表1。一水花、二水花和總產(chǎn)的鮮花產(chǎn)量同氮肥用量成正比，但隨著氮肥用量增加，各期花鮮花產(chǎn)量的增幅即氮肥增產(chǎn)效率將逐漸減小。一水花、二水花和總產(chǎn)的鮮花折干率是隨著氮肥用量的增加呈逐步降低趨勢(shì)，而三水花除N1處理鮮花折干率略低外，其他施氮處理間差異不顯著。

表1 氮肥用量對(duì)藥菊生長(zhǎng)和菊花產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of N application rates on the growth of C．morifolium and the yield of flowers

氮肥用量也顯著影響不同采收期鮮花產(chǎn)量占總產(chǎn)量的比例。N1和N2處理一水花產(chǎn)量占總產(chǎn)量的比例分別為0和25%，隨著氮肥用量的增加，高氮處理一水花的比例逐步增加到54%(N5處理);而二水花的比例由N1處理的57%降至N5處理的31%，三水花的比例由N1處理的44%逐步降至N5處理的16%。上述結(jié)果表明，施用氮肥可明顯提前藥菊植株的開(kāi)花期，而缺氮會(huì)導(dǎo)致藥菊開(kāi)花期推遲。將藥菊植株全生育期鮮花總產(chǎn)量(Y)同氮肥用量(X)進(jìn)行回歸分析，可得一元二次多項(xiàng)式模型：Y= －19.40+2214.98X －2184.76X2(n=20，r=0.994 9＊＊)，當(dāng)?shù)视昧繛镹 0.5069 g/kg土?xí)r，其鮮花總產(chǎn)量最高為542.01 g/株。

2.2 氮肥用量對(duì)藥菊葉片葉綠素含量的影響

從表2可知，低氮肥用量處理(N1、N2)植株葉片中(SPAD值)較低，隨著氮肥用量的提高，植株葉片中葉綠素含量(SPAD值)逐步上升。不同生育期相比，各處理葉綠素含量在生育前期較高(9月16日以前)，隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，葉綠素的含量將逐步降低;其中，低、中氮肥用量處理(N1、N2、N3)葉綠素含量(SPAD值)較生育前期分別下降了57%、59%和42%，而高氮肥用量處理(N4、N5)僅下降了30%和18%。上述結(jié)果表明，缺氮會(huì)影響藥菊植株葉片的葉綠素含量，從而影響植株的生長(zhǎng)。

表2 氮肥用量對(duì)藥菊葉片葉綠素含量(SPAD值)的影響Table 2 Effects of N application rates on leaf chlorophyll content(SPAD value)of C．morifolium

2.3 氮肥用量對(duì)藥菊葉片和花中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

從表3可知，藥菊葉片和花中的PAL活性同氮肥用量成反比，低氮肥用量處理(N1、N2)葉片和花中PAL活性高，且兩處理差異不顯著。隨著氮肥用量提高，藥菊葉片和花中的 PAL活性大幅度降低，三個(gè)時(shí)期的N5處理葉片中的PAL活性較N1處理下降了39% ～52%，花中下降了22%和40%，這表明施用氮肥會(huì)降低藥菊植株的PAL活性，從而對(duì)莽草酸次生代謝途徑產(chǎn)生一定的抑制作用。藥菊葉片中的PAL活性在采收期內(nèi)變化不大，而花中的PAL活性則是隨著采收期的推進(jìn)呈降低趨勢(shì)。另外，葉片中的PAL活性則顯著高于花，說(shuō)明葉片是莽草酸次生代謝途徑的主體。

表3 氮肥用量對(duì)藥菊葉片和花中苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響Table 3 Effects of N application rates on PAL activity in leaves and flowers of C．morifolium

2.4 氮肥用量對(duì)藥菊花中礦質(zhì)元素含量及其比例的影響

由表4可見(jiàn)，菊花中各礦質(zhì)元素含量大小順序?yàn)殁?K)＞氮(N)＞鈣(Ca)＞磷(P)。氮肥用量對(duì)花中礦質(zhì)元素含量及其比例也有顯著影響。隨著氮肥用量的提高，不同花期花中氮元素含量逐步提高;而花中磷、鉀、鈣含量則同氮肥用量或花中氮含量成反比。不同處理花中鉀含量隨著采收期的推進(jìn)呈逐步降低趨勢(shì)，磷含量在生育期內(nèi)變化不大;氮、鈣含量是中、低氮處理生育期內(nèi)變化不大;而高氮處理(N5)則呈逐步降低的趨勢(shì)。另外，隨著氮肥用量的提高，不同花期花中N/P、N/K和N/Ca均逐步升高。各處理花中N/K隨采收期的推進(jìn)呈逐步增加趨勢(shì)，而N/P和N/Ca是先降后升趨勢(shì)。

2.5 氮肥用量對(duì)菊花活性成分含量與累積量的影響

從表5可知，菊花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量同氮肥用量成反比，且氮肥用量越大，降低的幅度也越大，高氮處理(N5)不同花期上述三成分含量的下降幅度分別為35% ～45%、29% ～36%和6%～10%。這一結(jié)果表明，施用氮肥會(huì)抑制藥菊植株酚類(lèi)物質(zhì)的合成代謝，并顯著降低菊花中綠原酸和總黃酮的含量。與之相反，花中可溶性氨基酸含量同氮肥用量成正比，即隨著氮肥用量的提高，不同花期花中可溶性氨基酸含量逐漸增加。另外，菊花中綠原酸和總黃酮含量隨著采收期推進(jìn)逐漸降低，而可溶性糖和可溶性氨基酸含量則逐漸升高。

菊花中綠原酸、總黃酮、可溶性糖和可溶性氨基酸的累積總量同氮肥用量成正比，但隨氮肥用量增加，花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖累積總量的增幅逐漸降低，而可溶性氨基酸增幅則呈增加趨勢(shì)。將藥菊花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖的累積總量(Y)同氮肥用量(X)進(jìn)行回歸分析，可分別得一元二次多項(xiàng)式模型：Y綠原酸=0.02+1.83X－1.99X2(n=20，r=0.9875＊＊)，Y總黃酮=0.21+35.77X －42.79X2(n=20，r= 0.9934＊＊) 和 Y可溶性糖=－0.08 + 121.01X －132.18X2(n=20，r=0.9903＊＊);當(dāng)?shù)视昧糠謩e為 0.4598、0.4180 和0.4577 g/kg時(shí)，其花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖的累積總量最高，可分別為0.44、7.69和27.62 g/株。

表4 氮肥用量對(duì)菊花中氮、磷、鉀和鈣含量及其比例的影響Table 4 Effects of N application rates on the contents of N，P，K and Ca and the ratio of N/P，N/K and N/Ca in flowers of C．morifolium

表5 氮肥用量對(duì)菊花中綠原酸、總黃酮、可溶性糖和氨基酸含量的影響Table 5 Effects of N application rates on the contents of chlorogenic acid，total flavonoids，and soluble sugar and amino acid in flowers of C．morifolium

將二水花中各生理指標(biāo)、礦質(zhì)元素含量、活性成分含量及葉面有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表6。其中，花中氮含量及N/P、N/K和N/Ca同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量及葉片和花中的PAL活性之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，同花中可溶性氨基酸含量和葉片的葉綠素含量呈極顯著正相關(guān);磷、鉀和鈣含量同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量及葉片和花中的PAL活性之間呈顯著或極顯著正相關(guān)，同花中可溶性氨基酸含量和葉片SPAD值呈極顯著負(fù)相關(guān)。葉片的葉綠素含量同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量及葉片和花中的PAL活性之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，同花中可溶性氨基酸含量呈極顯著正相關(guān);葉片和花中的PAL活性同花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量之間呈極顯著正相關(guān)，同花中可溶性氨基酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。另外，花中綠原酸、總黃酮和可溶性糖含量三者之間互呈極顯著正相關(guān)，而三者同花中可溶性氨基酸含量之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)。其他兩期花的相關(guān)分析結(jié)果同二水花期的研究結(jié)果也是一致的。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，菊花為喜氮植物，氮肥對(duì)藥菊植株生長(zhǎng)和菊花產(chǎn)量有著顯著的促進(jìn)作用。施用氮肥促進(jìn)植株對(duì)氮的吸收，植株葉綠素含量也大幅增加，從而促進(jìn)其光合作用和干物質(zhì)的積累，并顯著促進(jìn)植株花芽分化，增加藥材產(chǎn)量和外觀(guān)品質(zhì)。但隨著氮肥用量的增加和菊花中氮含量逐步增高，花中磷、鉀和鈣含量降低，N/P、N/K和N/Ca比上升，從而導(dǎo)致植株中礦質(zhì)元素間比例失調(diào)，因而氮肥的增產(chǎn)效率和單位氮肥用量報(bào)酬率將逐步減小直至不再增產(chǎn)，這同祝麗香等［11］在杭白菊上的研究結(jié)果是一致的。

綠原酸和黃酮均為植物中莽草酸代謝途徑生成的次生代謝產(chǎn)物，是通過(guò)氮代謝產(chǎn)物苯丙氨酸在PAL的催化下解氨進(jìn)入莽草酸代謝途徑而生成，這一過(guò)程同植物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［15］，故氮肥用量過(guò)高將大幅降低菊花中綠原酸和總黃酮的含量，花中氮含量以及N/P、N/K和N/Ca與其綠原酸和總黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)也是該過(guò)程的表現(xiàn)。

同化產(chǎn)物糖是植物體內(nèi)黃酮類(lèi)成分次生合成代謝的起始物質(zhì)，且天然黃酮類(lèi)化合物多以苷類(lèi)形式存在，故糖對(duì)植物體內(nèi)黃酮類(lèi)成分的合成代謝影響比較大。根據(jù)碳素/營(yíng)養(yǎng)平衡假說(shuō)［16］：礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)脅迫(包括缺乏和毒害)時(shí)，植物生長(zhǎng)的速率大大降低，而光合速率保持相對(duì)穩(wěn)定，這樣植物會(huì)積累較多的碳水化合物，體內(nèi)碳素/營(yíng)養(yǎng)比增大，以碳素為基礎(chǔ)的次生代謝物質(zhì)(如黃酮等酚類(lèi)物質(zhì))就會(huì)增加。生長(zhǎng)/分化平衡假說(shuō)也認(rèn)為［17］，任何對(duì)植物生長(zhǎng)與光合作用有不同程度影響的環(huán)境因子，都會(huì)導(dǎo)致次生代謝物質(zhì)的變化，對(duì)植物生長(zhǎng)抑制作用更強(qiáng)的因素將增加次生代謝產(chǎn)物。Singh等［18］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植株氮素供應(yīng)不足時(shí)，由于植物體對(duì)氮再利用能力較強(qiáng)，植物體內(nèi)合成的苯丙氨酸將在PAL作用下解氨，釋放的NH4+會(huì)經(jīng)谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)途徑重新回到植物體內(nèi)的氮循環(huán)過(guò)程，從而使植物體內(nèi)有限的氮再循環(huán)利用，這一過(guò)程也有利于黃酮類(lèi)次生代謝物的生成。前人研究也證明，高氮降低蘋(píng)果葉片中總黃酮含量的機(jī)制在于使葉片PAL的活性降低［19］，高氮營(yíng)養(yǎng)條件下會(huì)促進(jìn)蕎麥中苯丙氨酸合成蛋白質(zhì)，從而抑制黃酮類(lèi)化合物的合成［20］。本研究中低氮肥用量條件下，藥菊植株氮素不足，這促使其體內(nèi)大部分苯丙氨酸解氨生成綠原酸和黃酮等酚類(lèi)物質(zhì)，并將解脫下來(lái)的氨繼續(xù)用于植株體內(nèi)的氮代謝。但在高氮條件下，藥菊植株氮素充足，抑制了其體內(nèi)綠原酸和黃酮成分的合成，從而促進(jìn)苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。

菊花中可溶性糖和可溶性氨基酸含量隨著采收期的推進(jìn)而增加，花中綠原酸和總黃酮含量是隨著采收期的推進(jìn)而降低，這與郭巧生等［21］的研究結(jié)果是一致的，其原因可能是采收期外界環(huán)境溫度逐步降低、晝夜溫差加大，低溫導(dǎo)致植株多糖和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分解為可溶性糖和可溶性氨基酸等小分子物質(zhì)從而提高植株抗寒性有關(guān)。菊花中綠原酸和總黃酮含量是隨著采收期的推進(jìn)而降低，這與郭巧生等［21］的研究結(jié)果也是一致的，其原因可能與菊花采摘部位變化、花中PAL活性降低和次生代謝產(chǎn)物的前體底物降少等因素有關(guān)。

在藥用菊花生產(chǎn)上，應(yīng)注意合理施用氮肥。綜合比較氮肥用量對(duì)菊花藥材產(chǎn)量、外觀(guān)品質(zhì)、活性成分含量與累積量等因素的影響，建議菊花生育期內(nèi)氮肥用量在0.30～0.40 g/kg為適宜。關(guān)于氮肥品種和氮肥運(yùn)籌對(duì)菊花生長(zhǎng)及其藥用品質(zhì)的影響，以及不同氮肥用量條件下菊花植株各礦質(zhì)元素的吸收和分配規(guī)律，還有待進(jìn)一步研究。

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