王雪松 李常國(guó)

（遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所，沈陽(yáng) 110023）

馬立克氏病（MD）是最常見(jiàn)的一種雞淋巴組織增生性傳染病。它是由馬立克氏病毒（MDV）引起雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤疾病，以淋巴組織的增生和腫瘤形成為特征。馬立克氏病是危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的病毒性腫瘤性傳染病。MD經(jīng)羽毛囊排毒，空氣傳播，傳染力極強(qiáng)，是雞的3大主要疫病之一。該病于1907年由匈牙利病理學(xué)家Joseph Marek首先報(bào)道，1961年在英國(guó)科學(xué)家Biggs的倡導(dǎo)下，開(kāi)始使用馬立克病這一名稱。MD存在于世界所有養(yǎng)禽的國(guó)家和地區(qū)，其危害隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化而增大，此病一旦發(fā)生，即可引起雞大批死亡，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。MD是一種高度接觸性疾病，通過(guò)直接或間接接觸傳播，也可通過(guò)空氣傳播。

在實(shí)習(xí)期間，我們確診4例MD。病雞大多表現(xiàn)為精神不振，食欲減退，羽毛松散，縮頭耷翅，雞冠和肉髯蒼白萎縮，貧血，排水樣稀便及黃白色或黃綠色下痢。病雞消瘦迅速，體重減輕，昏迷，最后衰竭死亡。通過(guò)剖檢變化，病理組織學(xué)觀察以及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，在與其他癥狀相似的疾病相鑒別后，最后確診為雞馬立克氏病。

MD主要侵害外周神經(jīng)系統(tǒng)，以周圍神經(jīng)、性腺、虹膜、內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚的單獨(dú)或多發(fā)的單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征[1]。該病具有高度傳染性，也是一種免疫抑制性疾病[2]。

MDV在細(xì)胞培養(yǎng)條件下呈一種嚴(yán)格細(xì)胞結(jié)合狀態(tài)，MD的病原是在1967年由Churchill和Biggs．通過(guò)體外增殖和后來(lái)從MD腫瘤細(xì)胞分離獲得皰疹病毒才得以確定的。目前，將MDV毒株分為3個(gè)血清型。其中，引起腫瘤的MDV毒株被歸為l型，天然不致瘤的MDV為2型，而HVT毒株為3型[3]。

目前，采用免疫雞群攻毒保護(hù)試驗(yàn)來(lái)判定MDV毒力的強(qiáng)弱，將血清l型MDV分為四種病原型，即溫和型（mMDV）、強(qiáng)毒型（vMDV）、超強(qiáng)毒型（vvMDV）、特超強(qiáng)毒型（vv+MDV），其中每種致病型都有特定的臨床癥狀[4]。

MD是目前已知的唯一可用疫苗成功預(yù)防的病毒性腫瘤病，因而在比較醫(yī)學(xué)上，它是研究病毒性腫瘤的發(fā)生和預(yù)防機(jī)制的理想的動(dòng)物模型。MDV是一群細(xì)胞結(jié)合型的皰疹病毒科的成員，在感染細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)85～l00 nm的無(wú)囊膜病毒粒子，稱為核衣殼。MDV的基因組成雙股線形DNA，長(zhǎng)度約為180 kb，裸露的病毒DNA對(duì)單層細(xì)胞和易感雞都有感染性。MD的發(fā)生和嚴(yán)重程度，取決于病原、宿主和環(huán)境，這3者密切相關(guān)[5]。

本病無(wú)特效藥物治療，只能依靠免疫預(yù)防。也許只有時(shí)間才能告訴我們目前家禽業(yè)所采取的措施能否會(huì)給發(fā)生突變的MDV得以逃逸及增強(qiáng)其毒力的機(jī)會(huì)[7]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病料 撫順地區(qū)某農(nóng)戶送檢的病死雞5只。

1.1.2 試劑 MD陽(yáng)性血清、MD沉淀抗原、甲醛、酒精（95%）、二甲苯、石蠟、甘油、蘇木素、鉀明礬、鉀明礬、曙紅、NACL。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、切片機(jī)、水浴鍋、座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、微量移液器、電爐、平皿、架盤(pán)藥物天平、砝碼、藥匙、量筒、燒杯、玻璃棒、紗布、漏斗、毛刷、剪子、手術(shù)刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、木塊、廢液缸、酒精燈、濾紙、樹(shù)膠、新鮮蛋白等。

1.1.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)平板制作 首先稱取1g瓊脂粉，加至100mL8.5% 的高滲鹽水中，煮沸使之溶解（在電爐子上加熱，邊加熱邊攪拌，直到溶液由渾濁變澄清為止）。然后待溶解的瓊脂溫度降至55℃左右時(shí)，將其倒入滅菌清潔的平皿中，厚度約2 mm。在瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔。一般的打孔器有 7個(gè)孔，中心孔孔徑為3 mm，周邊孔孔徑為3ml，孔距為3 ml。孔內(nèi)的瓊脂如未吸出，則用注射器針頭挑出。最后將平皿在酒精燈上烘烤背面（溫度不宜過(guò)高，以不燙手為宜）使瓊脂與平皿貼緊。

1.1.5 試劑配制

固定液配制：福爾馬林液

福爾馬林（37%-40%甲醛）：100 ml 常水：500 ml蘇木素染液：

第1液配方：蘇木素1 g、無(wú)水酒精10 ml。第2液配方：鉀明礬 20 g、蒸餾水200 ml。

第1液和第2液分別配制，第2液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后加入第1液中，盛染液的瓶口蓋上紗布，置應(yīng)用于日光下照射約2周，經(jīng)過(guò)過(guò)濾后可以使用。

伊紅水溶液的配制：伊紅（水溶性）1 g、蒸餾水100 ml， 混合后溶解即可應(yīng)用，密封保存。

1%鹽酸酒精液的配制：70%的酒精100 ml、濃鹽酸1 ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病理剖檢

將送檢的病例進(jìn)行尸體剖檢，外部檢查之后用清水將禽體羽毛浸濕，切開(kāi)大腿與腹側(cè)連接的皮膚，用力將兩大腿向外翻壓直到兩髖關(guān)節(jié)脫臼，使禽體背臥位平躺。在泄殖孔前的皮膚作一條橫切線，由此切線中部沿腹中線由后向前剪開(kāi)皮膚，直到喙角，使腹部和胸部皮膚分離，進(jìn)行臨床剖檢診斷。

在對(duì)臨床癥狀、尸體剖檢的基礎(chǔ)上，從待檢雞的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓豐富的羽毛供實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，以尋求確診。

1.2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

采集羽髓：從被檢雞的羽毛豐厚處拔下羽毛，從羽根尖端剪下1 cm左右的一段，注意要露出羽髓。

加樣：取瓊脂平板1個(gè)，將瓊脂平板6個(gè)孔編號(hào)，分別取5根露出羽髓的羽根，直接將其插入外周1、2、3、4、5孔中，外周的第6孔中用微量移液器加入MD標(biāo)準(zhǔn)抗原，向中心孔中加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。然后將加樣完畢的瓊脂板加蓋平放于帶蓋的濕盒內(nèi)，置37℃溫箱中，24 h內(nèi)觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：被檢材料與中心陽(yáng)性血清空之間形成清晰的沉淀線則判為陽(yáng)性，否則即為陰性。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察

取材固定；脫水透明；浸蠟包埋；切片貼片；修整展片；H·E染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理解剖學(xué)變化

組織器官：皮膚表面出現(xiàn)多個(gè)、大小不等的、灰白色的腫瘤結(jié)節(jié)；心臟：表面有大小的灰白色結(jié)節(jié)，稍突出于心臟表面；肝臟：明顯腫大，表面有白色小結(jié)節(jié)；脾臟：彌散性腫大；腎臟：彌漫性腫大并呈灰白色；腺胃壁：增厚?？蓞⒖紙D1所示變化。

圖1 肝臟明顯腫大，表面有白色腫瘤結(jié)節(jié)

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

羽髓瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，外周2、3、4、5、6孔的羽髓與中央的陽(yáng)性血清之間均形成清晰的灰白色沉淀線，證明2、3、4、5這4根羽髓的AGP試驗(yàn)為陽(yáng)性，1孔未形成沉淀線，為AGP試驗(yàn)陰性，而6孔為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性。

圖2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病理組織學(xué)觀察

2.2.1 心臟 心肌纖維顆粒變性、水泡變性。在血管周圍、肌纖維間、心外膜下有淋巴細(xì)胞呈浸潤(rùn)性增生。肌纖維脂肪變性，局部蠟樣壞死。

2.2.2 脾臟 鞘動(dòng)脈周圍、淋巴小結(jié)出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞。淋巴細(xì)胞核碎裂、邊集，并見(jiàn)核分裂相。

2.2.3 肝臟 肝細(xì)胞顆粒變性、水泡變性、部分壞死。竇周隙狹窄，散在少量的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，狄氏隙擴(kuò)張。中、小淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞在靜脈周圍浸潤(rùn)。在肝小葉內(nèi)局灶性增生。增生灶內(nèi)有呈空泡狀的原始網(wǎng)狀細(xì)胞和核邊集的凋亡淋巴細(xì)胞。肝細(xì)胞壞死處有淋巴細(xì)胞集聚（詳見(jiàn)圖3）。

2.2.4 腎臟 腎小球體積增大。腎小囊腔狹窄。并有血紅蛋白樣物質(zhì)。腎小囊壁上皮細(xì)胞腫脹。局部腎小球萎縮，出現(xiàn)代償性增大。腎小管上皮細(xì)胞從顆粒變性、水泡變性到細(xì)胞壞死、胞膜破裂，整個(gè)腎小管呈均質(zhì)紅染。腎小管內(nèi)有血紅蛋白樣物質(zhì)，呈尿管型（詳見(jiàn)圖4）。

2.2.5 坐骨神經(jīng) 神經(jīng)纖維間水腫液內(nèi)散在中小淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞。局部灶性增生。

2.2.6 卵巢 皮質(zhì)和髓質(zhì)見(jiàn)有結(jié)節(jié)性或彌漫性網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞集聚。淋巴細(xì)胞核顯分裂相，局灶性增生細(xì)胞排列呈渦漩狀。部分卵泡全部被多形態(tài)淋巴細(xì)胞所代替。

2.2.7 腺胃 腺小管腺細(xì)胞開(kāi)始呈顆粒變性、水泡變性，逐漸壞死，腺小管內(nèi)散在流失的胞漿。淋巴細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞在腺小管間、肌層間、漿膜下浸潤(rùn)和增生。

2.2.8 十二指腸 肌層肌細(xì)胞和腸絨毛上皮細(xì)胞變性、壞死。漿膜、漿膜下、肌層、腸腺間和絨毛固有層出現(xiàn)不同程度的大中小淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和增生。腸腺間有網(wǎng)狀細(xì)胞增生。

2.2.9 肺 血管內(nèi)、外散在淋巴細(xì)胞。血管周圍肺小葉間隔有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局部肺泡間隔及支氣管周圍充滿大量的大中小淋巴細(xì)胞、少量的網(wǎng)狀細(xì)胞。肺小葉內(nèi)充滿淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞，局部實(shí)質(zhì)內(nèi)全被腫瘤細(xì)胞代替。

圖3 肝細(xì)胞管內(nèi)有多形態(tài)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

圖4 腎小管之間見(jiàn)數(shù)量不等淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)

3 結(jié)論與討論

3.1 羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

3.1.1 試驗(yàn)原理 羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是沉淀反應(yīng)試驗(yàn)的一種，以瓊脂凝膠作為載體，在1%以下的瓊脂凝膠中可形成大于85 nm的微孔，可溶性抗原或抗體能在其中自由擴(kuò)散，并由近及遠(yuǎn)形成濃度梯度。抗原和抗體在比例適當(dāng)處相遇，形成顆粒較大的抗原-抗體復(fù)合物而不再擴(kuò)散，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白色沉淀線。一種抗原抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀線，復(fù)合抗原中的多種抗原抗體系統(tǒng)均可以根據(jù)自己的濃度、擴(kuò)散系數(shù)、最適比等因素，形成自己的沉淀線。

3.1.2 試驗(yàn)特點(diǎn) 羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不需要精密的儀器且操作簡(jiǎn)單，技術(shù)上易掌握，在我國(guó)目前條件下比熒光抗體技術(shù)和免疫電泳等易于在基層獸醫(yī)站或檢驗(yàn)室推廣應(yīng)用。羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)所形成的沉淀線不但易于攝影記錄，并可經(jīng)染色后做永久標(biāo)本。在與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的比較中，羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率要高于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；應(yīng)用本試驗(yàn)可以在同一個(gè)平皿中同時(shí)檢測(cè)多種抗原或抗體，并可就反應(yīng)后形成沉淀線的多少來(lái)辨識(shí)抗原是否純凈，因此適用于分析多種抗原成分的材料。應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的缺點(diǎn)是試驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

3.1.3 注意事項(xiàng) 應(yīng)多拔幾根新羽來(lái)檢查；加樣時(shí)，以把孔加滿為度，切忌樣品溢出，影響判定結(jié)果；與鄰接孔連片時(shí)應(yīng)作廢處理；MD陽(yáng)性血清避免反復(fù)凍融，以防降低效價(jià)而影響檢出結(jié)果；在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)時(shí)，還要注意羽囊同時(shí)緣孔緊密吻合，防止羽囊徑小，邊緣孔大，否則抗原擴(kuò)散不充分，降低查檢率。

3.2 病理組織學(xué)觀察

3.2.1 組織固定 用于組織固定的材料必須新鮮，采集和分割后要立刻固定，不得延誤；固定材料體積的大小，以不超過(guò)直徑5 mm為準(zhǔn)，材料與固定液的比例，以1∶20為準(zhǔn)；所用固定液以新配的為好，并放置在陰涼處，不要在日光下直曬；材料固定完畢后，必須在容器外貼上標(biāo)簽，以防止相互混淆。

3.2.2 組織脫水 組織脫水是在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng)，否則易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體；在高濃度酒精中，每級(jí)停留時(shí)間也不宜太長(zhǎng)，否則可使組織收縮變脆，影響切片；脫水應(yīng)徹底干凈，否則與二甲苯混合后，將呈乳白色渾濁，雖然可以倒回重脫，但效果不好；如需過(guò)夜，應(yīng)停留在70%酒精中。

3.2.3 組織塊透明 組織塊透明時(shí)要注意二甲苯極易揮發(fā)，故在切片透明之后，從染色缸中取出封藏，手續(xù)要敏捷，不宜久置，否則待二甲苯揮發(fā)干凈后，組織就會(huì)變硬發(fā)白，即使再加樹(shù)膠封藏，由于樹(shù)膠不能浸入組織，封后也無(wú)用處；二甲苯極易吸收空氣中的水分，故在濕度大的天氣，貯有二甲苯的染色缸的蓋子周緣可涂少許凡士林，以防止水分的滲入。在封片時(shí)也不宜將口鼻過(guò)分靠近切片，以免水氣侵入，出現(xiàn)白色云霧狀；二甲苯必須保持無(wú)水無(wú)酸。若用1～2滴石蠟油滴入其中，立即出現(xiàn)云霧狀，即表示其中已含有水分，不能再用。

3.2.4 石蠟切片制作 檢驗(yàn)過(guò)程中，石蠟切片制作出現(xiàn)了材料裂隙、破碎的情況，請(qǐng)做類似試驗(yàn)時(shí)借鑒。

3.6 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)對(duì)一起疑似馬立克氏病的病死雞進(jìn)行臨床剖檢診斷，初步確診為雞馬立克氏病。

（2）在臨床診斷的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了羽囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和病理組織學(xué)診斷。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果表明，被檢的5份病料中，4分為陽(yáng)性，1份為陰性。

（3）通過(guò)對(duì)病雞的各臟器進(jìn)行病理組織學(xué)觀察檢測(cè)結(jié)果表明，各臟器具備典型的馬立克氏病的病理組織學(xué)變化。

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