肖 俊 ，曹春瑜 ，周 靜 ，汪衛(wèi)紅

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.腎內(nèi)科；b.體檢科，南昌 330006）

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是一種免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎，以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主要特征，其臨床病理表現(xiàn)多樣，發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。目前認(rèn)為其發(fā)病主要是由于免疫清除功能受損及黏膜水平抗原清除缺陷，與細(xì)胞免疫有著密切關(guān)系[1]。 以往研究[2]發(fā)現(xiàn)，IgAN 中存在 Th1/Th2 的失衡，但對(duì)是Th1還是Th2占優(yōu)勢(shì)仍有爭(zhēng)議，而Th1/Th2失衡在IgAN中的作用亦尚未闡明。Th3細(xì)胞是不同于Th l、Th2的一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制調(diào)節(jié)功能，除抑制與調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、分化和活性，亦可抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生，主要依賴其分泌的TGF-β1發(fā)揮作用，Th3在IgAN中的作用少見報(bào)道。本研究旨在通過觀察IgAN患者外周血中Th1、Th2、Th3的表達(dá)變化，探討IgAN免疫失調(diào)的發(fā)病機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2011年7月至2012年5月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢確診為IgAN患者（IgAN組）23例，男 8例，女 15例，年齡 22～45歲，病程 1～180個(gè)月。其中肉眼血尿5例，單純性鏡下血尿3例，蛋白尿合并血尿17例；合并高血壓5例、水腫4例。均排除過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝病毒相關(guān)性腎炎及肝硬化等，1個(gè)月內(nèi)均未使用激素及免疫抑制劑。選擇同期在本院體檢的健康體檢者（正常對(duì)照組）20例，男6例，女14例，年齡21～43歲。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標(biāo)的檢測(cè)

標(biāo)本采集：1）血標(biāo)本的采集。2組晨空腹抽取肘靜脈血 5 mL，1 200 r·min-1離心 5 min，取血清，放置-70℃冰箱待測(cè)，避免反復(fù)凍融。2）尿標(biāo)本的采集。取清潔晨尿送檢尿常規(guī)；準(zhǔn)確收集24 h尿液，加入防腐劑，混勻?；靹蚝螅蜋z24 h尿蛋白定量。

檢測(cè)方法：采用比色測(cè)定法、使用1650生化分析儀（德國Bayer公司）檢測(cè)24 h尿蛋白定量、血尿酸及血肌酐水平，試劑盒購自德國Bayer公司；采用免疫比濁法、使用800雙光徑免疫比濁分析儀（美國Beckman Immage公司）檢測(cè)血IgA水平，試劑盒購自美國BeckmanImmage公司，并根據(jù)較正的MDRD公式[3]計(jì)算腎小球?yàn)V過率（eGFR）。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

2組晨空腹抽取肘靜脈血 3～5 mL，肝素鈉抗凝，F(xiàn)icoll（ρ=11 077）密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞備用。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1、Th2、Th3細(xì)胞比例

1）采用RPMI-1640調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度至5×105mL-1，每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中。將PMA 25 μg·L-1、ionomycin 1 mg·L-1、monensin 1.7 mg·L-1分別加入96孔培養(yǎng)板中，置37℃、310 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中刺激培養(yǎng)5 h。2）CD3、CD8為表面標(biāo)志，用CD3+CD8+T細(xì)胞來代表CD4+T細(xì)胞。3)將刺激后的單個(gè)核細(xì)胞分為陰性對(duì)照、IFN-γ、IL-4 及 TGF－β14 管，均加入抗 CD3-PEcy5（美國Biosceince公司）、CD8-FITC （美國Beckman公司）單克隆抗體各10 μL，4℃避光孵育30 min。固定破膜后，再加入抗 IFN-γ-PE、IL-4-PE、TGF－β1－PE 單克隆抗體（美國Biolegend公司）或同型對(duì)照IgG1-PE各20 μL，室溫避光孵育15 min。洗滌后，重懸待測(cè)。4）流式細(xì)胞儀檢測(cè)：使用Facscalibur型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)同型對(duì)照調(diào)整電壓，設(shè)定陰性范圍。同時(shí)，設(shè)立3種熒光單獨(dú)標(biāo)記的細(xì)胞染色管調(diào)整儀器熒光補(bǔ)償。根據(jù)前向角和側(cè)向角（FSS/SSC）圈定淋巴細(xì)胞設(shè)門G1，每份標(biāo)本獲取G1門20 000個(gè)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞表達(dá)。以CD3陽性設(shè)門，分析CD3+CD8-IFN-γ+即Th1細(xì)胞、CD3+CD8-IL-4+即 Th2細(xì)胞及 CD3+CD8-TGF-β1+即Th3細(xì)胞在CD3+T淋巴細(xì)胞中的比例。以 Cell-Quest、FlowJo software軟件（美國 Becton Dickinson公司）收集分析數(shù)據(jù)。

1.3 高尿酸血癥的判斷標(biāo)準(zhǔn)

血IgA＞3.45 g·L-1定義為血IgA水平升高。血尿酸男性＞420 μmol·L-1，女性＞350 μmol·L-1定義為高尿酸血癥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2組的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2組一般資料比較見表1。

2.2 外周血 Th1、Th2、Th3、Th1/Th2 細(xì)胞水平的變化

IgAN組外周血中Th1細(xì)胞比例較正常對(duì)照組減少， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；IgAN組外周血中Th2、Th3細(xì)胞比例均顯著高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；IgAN組存在Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，Th1/Th2細(xì)胞比值較正常對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。

表1 2組一般資料比較

表2 2組Th1、Th2、Th3細(xì)胞比例及Th1/Th2細(xì)胞比值的比較 ±s

表2 2組Th1、Th2、Th3細(xì)胞比例及Th1/Th2細(xì)胞比值的比較 ±s

#P＞0.05、*P＜0.05 與正常對(duì)照組比較。

組別 n Th1/% Th2/% Th3/% Th1/Th2細(xì)胞比值IgAN 組 23 13.14±3.11# 2.17±0.62* 3.17±1.15* 6.05±1.92*正常對(duì)照組 20 15.25±4.16 1.42±0.83 2.72±1.03 10.73±5.79

2.3 外周血Th細(xì)胞分布頻率與臨床相關(guān)性分析

IgAN 組血清 IgA 水平為（3.50±0.90）g·L-1，24 h尿蛋白定量為（0.70±0.60）g·d-1，血尿酸為（359.00±119.00） μmol·L-1，eGFR 為（61.10±42.10）mL·min-1。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IgAN組外周血Th2、Th3細(xì)胞比例與血清IgA水平呈正相關(guān)（r=0.468、0.521，均 P＜0.05），IgAN 組外周血 Th2、Th3 細(xì)胞比例與 24 h尿蛋白定量、血尿酸、eGFR水平均無相關(guān)性（r=0.016、0.124、-0.323、0.042、0.225、-0.473，均 P＞0.05）。

3 討論

IgAN的發(fā)病與IgA免疫系統(tǒng)的異常密切相關(guān)[4]。IgA1由多克隆活性B細(xì)胞生成,而B細(xì)胞分泌IgA1的過程受T細(xì)胞調(diào)控。因此，T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂，可能會(huì)導(dǎo)致失控的B細(xì)胞產(chǎn)生過量及異常的IgA1。陳琦等[5]通過比較IgAN及非腎炎患者扁桃體T淋巴細(xì)胞分布，認(rèn)為IgAN與扁桃體局部免疫異常有關(guān)。近期研究[6]顯示，T細(xì)胞尤其是輔助性T細(xì)胞的極化改變對(duì)IgA糖基化的形式改變及腎臟損害均有直接或間接的影響。由此可見，T細(xì)胞的調(diào)控失?？赡苁侵虏〉腎gA1產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)。

輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）在誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)分泌各種免疫球蛋白中起重要作用。根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同，主要分為Th1、Th2兩個(gè)亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2等，參與細(xì)胞免疫，介導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌IgG2、IgG3的B細(xì)胞；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等，介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)產(chǎn)生分泌IgG4、IgE和IgA的B細(xì)胞。以往研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2平衡狀態(tài)在腎臟疾病的不同表現(xiàn)類型中改變不同：在ANCA-相關(guān)腎小球腎炎、鏈球菌感染后腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎中，免疫反應(yīng)以Th1為主導(dǎo)；在微小病變和原發(fā)性膜性腎病中，以Th2為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)。對(duì)于Th1/Th2在人類IgA腎病致病中的作用，目前仍有爭(zhēng)議[11]。 多數(shù)研究[12-15]認(rèn)為，IgAN 中 Th1/Th2平衡向Th2偏倚，促進(jìn)IgA分泌增多，從而參與IgAN 發(fā)病。 Nogaki F.等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性產(chǎn)生IgAN的ddY小鼠模型中，幼鼠呈Th1優(yōu)勢(shì)，但隨年齡增長卻呈Th2優(yōu)勢(shì)，IgA分泌增加。由此認(rèn)為，IgA的產(chǎn)生可能與Th1/Th2平衡向Th2偏倚有關(guān)。Ebihara I.等[13]在單個(gè)細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，IgAN 患者外周血分泌Th2類細(xì)胞因子的細(xì)胞比例增多，也顯示IgAN患者免疫失衡呈Th2優(yōu)勢(shì)。另有研究通過ELISA[14]和 RT-PCR 法[15]同樣證實(shí)了 IL-4 等 Th2類細(xì)胞因子在IgAN中表達(dá)增多，但也有少數(shù)研究取得了相反的結(jié)果，Lai K.N.等[16-17]用 ELISA 法檢測(cè)IgAN患者外周單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)Th1類細(xì)胞因子增多。然而，他們?cè)趍RNA水平的研究卻又顯示Th1和Th2細(xì)胞均增多。筆者通過流式細(xì)胞儀多重染色技術(shù)檢測(cè)IgAN患者外周血Th1、Th2的分泌情況來觀察Th1/Th2的平衡狀態(tài)。結(jié)果顯示，IgAN組外周血中Th2細(xì)胞比例明顯增高，Th1細(xì)胞改變不明顯，Th1/Th2細(xì)胞比值明顯降低。證實(shí)IgAN存在免疫失衡，Th2優(yōu)勢(shì)明顯，且與血IgA的水平呈正相關(guān)。

Th3細(xì)胞是由口服抗原誘導(dǎo)的小鼠腸系膜淋巴結(jié)中分離的一類能產(chǎn)生以TGF-β1為主的、獨(dú)特的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群[18]，對(duì)免疫應(yīng)答發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。G.J.Prud’homme等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Th3 細(xì)胞可以抑制 Th1、Th2 細(xì)胞過度活化,在糾正Th1/Th2的失衡過程中起重要作用。H.L.Weiner[20]研究發(fā)現(xiàn)，Th3 細(xì)胞可以依賴其分泌的TGF-β1，發(fā)揮其抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。另外，Th3細(xì)胞是通過高分泌TGF-β1在維持免疫自穩(wěn)中起著重要作用。楊軍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在過敏性紫癜患兒急性期外周血Th3細(xì)胞減少，可能是導(dǎo)致其免疫失衡的重要原因，但目前少見國內(nèi)外有Th3細(xì)胞在IgAN中的報(bào)道。以往研究[22]發(fā)現(xiàn)，IgAN患者血清中Th3類細(xì)胞因子TGF－β1水平升高，可促進(jìn)IgA的產(chǎn)生，導(dǎo)致IgAN的發(fā)生。筆者的研究通過流式細(xì)胞儀多重染色技術(shù)檢測(cè)Th3細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)IgAN患者外周血Th3細(xì)胞比例增多，且與血清IgA水平呈正相關(guān)。因此，推測(cè)Th3細(xì)胞在外周血中的增多，一方面可能會(huì)抑制Th細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，造成抗原的持續(xù)存在，引起異常IgA的清除障礙，導(dǎo)致IgA在腎臟的沉積。另一方面可能通過分泌TGF－β1，促使IgA產(chǎn)生增多，參與IgAN的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，IgAN患者外周血中存在Th細(xì)胞亞群的分布紊亂，表現(xiàn)為Th1/Th2平衡向Th2偏倚以及外周血中Th3的細(xì)胞比例增多。提示，T細(xì)胞亞群的分布紊亂可能在IgAN免疫發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其可能的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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