賈麗娜,宋 友

(1.佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科,黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科,黑龍江 佳木斯 154003)

腦血管疾病有幾個(gè)主要的特點(diǎn),即發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高。據(jù)國(guó)外統(tǒng)計(jì)資料,腦血管疾病以缺血性為多見(jiàn) ,約占75%～90%,因此,對(duì)缺血性腦血管病的研究也尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),腦梗死后超早期恢復(fù)腦血流供應(yīng),即溶栓治療,是減少半暗帶,促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)的最佳方案,通常臨床醫(yī)師會(huì)主張?jiān)谶@一時(shí)段行溶栓治療,但大量報(bào)道也顯示了血液再灌注對(duì)腦組織的損害,即腦缺血再灌注損傷。因此,如何減少腦缺血再灌注損傷,是眾多學(xué)者面臨的問(wèn)題。近幾年,人們發(fā)現(xiàn)缺血后處理是一種減少腦缺血再灌注損傷的方法,但具體的作用機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察缺血后處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠 Bcl-xl、Bax的影響,揭示缺血后處理減少腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制,為腦梗死尋找一條更有效的溶栓方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)分組

成年 雄性 Wistar大鼠 144只,體重 250～ 300g,隨機(jī) 分成三組 ,其中假手術(shù)組48只,對(duì)照組(腦缺血再灌注組)48只,缺血后處理組48只。

1.2 局灶性腦缺血再灌注模型的建立

采用大腦中動(dòng)脈栓線法:用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉。取頸部正中稍右0.5cm作切口,切開(kāi)皮膚皮下組織,分離頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈 (ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA),結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端,用小血管夾夾住頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端(頸總動(dòng)脈結(jié)扎處與上血管夾處保持5mm左右距離),在此處放置一打好結(jié)的備用絲線,勿收緊絲線 ,在此絲線下端剪一小口,插入已制備好的栓線頭端 ,收緊線結(jié),松去血管夾,在近頸總動(dòng)脈分叉處用眼科鑷暫時(shí)夾閉頸外動(dòng)脈,將栓線經(jīng)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈送至顱內(nèi),入線深度由分叉部算約18～ 19mm,收緊備線,外留1cm線頭,縫合皮膚。需再灌注時(shí)輕輕提拉所留線頭至有阻力時(shí)表明魚線頭端已至頸總動(dòng)脈切口處,則再灌注模型建立。

1.3 假手術(shù)組、腦缺血再灌注組及缺血后處理組大鼠的制備

假手術(shù)組:手術(shù)過(guò)程同缺血再灌注組,但僅暴露頸總動(dòng)脈分叉處,不插線阻斷大腦中動(dòng)脈。對(duì)照組(缺血再灌注組):大腦中動(dòng)脈線栓阻閉 90min。缺血后處理組:大腦中動(dòng)脈線栓阻閉90min后 ,將魚線略拔出,再灌注30s,再將魚線置入初始位置,缺血30s,反復(fù)3次。各組大鼠分別再灌注12h、24h、48h、72h后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4 免疫組織化學(xué)法測(cè)定 Bcl-xl、Bax蛋白的表達(dá)

采用鏈酶親和素—生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化染色方法:用過(guò)量4%戊巴比妥鈉麻醉,經(jīng)升主動(dòng)脈生理鹽水(37℃)灌注至血液變清,用含4%多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.4,4℃)緩沖液200mL灌流固定,斷頭取腦 ,置于上述固定液中固定24h,取以視交叉為中心相當(dāng)于前聯(lián)合連續(xù)腦片,再常規(guī)脫水浸蠟制成石蠟切片。①切片常規(guī)脫蠟置水。②3%H2O2室溫孵育20min,抑制內(nèi)源性過(guò)氧化酶,0.01mol/LPBS(pH7.4)洗 3次 ,每次 3min。③切片浸入 0.01枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0),微波爐加熱至98℃進(jìn)行抗原修復(fù),間隔 5min再進(jìn)行一次,自然冷卻后 PBS洗3次,每次3min。④滴加山羊血清封閉液 20min,封閉非特異性背景,傾去多余液體,不洗。⑤滴加 1:100的 Bcl-xl、Bax抗體,放入4℃冰箱中過(guò)夜,PBS洗3次,每次3min。⑥滴加生物素化羊抗兔 IgG即用液,37℃溫箱孵育 20min,PBS洗3次,每次 3min。⑦滴加辣根標(biāo)記的鏈酶親和素,37℃溫箱孵育20min,PBS洗3次,每次3min。⑧DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,雙氧水終止反應(yīng),一般為 8～10min,蘇木素輕度復(fù)染 (1min),脫水,透明,封片 ,顯微鏡下觀察。

1.5 結(jié)果判定

Bcl-xl蛋白、Bax蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均為胞漿呈棕褐色,以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) /10× 40高倍視野表示。每只動(dòng)物隨機(jī)取 2張切片,每張切片缺血側(cè)隨機(jī)觀察5個(gè)視野。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

局灶性腦缺血后進(jìn)行再灌注,缺血再灌注組與假手術(shù)組相比,各時(shí)間點(diǎn) Bcl-xl蛋白表達(dá)明顯降低,Bax蛋白表達(dá)明顯增高,差異具有顯著性 (P ＜0.01)。若在局灶性腦缺血后再灌注前進(jìn)行后處理,Bcl-xl蛋白在缺血后處理組的表達(dá)24h達(dá)高峰,且缺血后處理組 Bcl-xl蛋白的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)明顯高于缺血再灌注組 (P＜0.01);而 Bax蛋白無(wú)論缺血后處理組和缺血再灌注組其表達(dá)高峰均在24h,但缺血后處理組 Bax蛋白的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)明顯低于缺血再灌注組(P ＜ 0.01)見(jiàn)表1(圖 1,2)。

表1 各組大鼠腦組織 Bcl-xl蛋白、Bax蛋白表達(dá)變化(±s,n=6)

表1 各組大鼠腦組織 Bcl-xl蛋白、Bax蛋白表達(dá)變化(±s,n=6)

注:A組為假手術(shù)組,B組為缺血再灌注組,C組為缺血后處理組。*與假手術(shù)組比較 P＜0.01;△ 與缺血再灌注組比較 P＜0.01。

組別 12h 24h 48h 72h Bcl-xl A組 5.6± 1.8 6.1± 1.6 5.4± 0.8 5.3± 0.9 B組 2.4± 1.3* 3.9± 0.4* 3.7± 0.7* 2.8± 0.5*C組 10.5± 1.8△* 46.2± 8.4△* 26.6± 7.5△* 11.3± 3.5△*Bax A組 1.8± 0.9 2.5± 0.7 2.3± 1.0 1.9± 0.4 B組 18.7± 3.8* 36.3± 5.9* 22.5± 3.6* 16.2± 1.7*C組 5.1± 1.7△* 21.9± 3.4△* 11.4± 2.7△* 10.5± 1.8△*

圖1 對(duì)照組24h Bcl-xl蛋白表達(dá)(×400)對(duì)照組48h Bcl-x l蛋白表達(dá)(×400)

缺血后處理組24h Bcl-xl蛋白表達(dá)(×400)缺血后處理組48h Bcl-xl蛋白表達(dá)(×400)

圖2 對(duì)照組 24h Bax蛋白表達(dá)(×400) 對(duì)照組48h Bax蛋白表達(dá)(×400)

缺血后處理組24h Bax蛋白表達(dá)(×400)缺血后處理組48h Bax蛋白表達(dá)(×400)

3 討論

腦缺血后處理(brain ischemic postconditioning,BIPC)是指腦缺血后、在長(zhǎng)時(shí)間的再灌注之前,進(jìn)行的數(shù)次短暫再灌注 /缺血的循環(huán)[1]。2003年發(fā)現(xiàn)缺血后處理可以減少缺血再灌注損傷以來(lái),受到了人們的廣泛關(guān)注。許多學(xué)者認(rèn)為缺血后處理是機(jī)體另一種內(nèi)源性抗再灌注損傷的保護(hù)措施,其減少腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制與其抗凋亡作用有關(guān),但具體情況尚在研究階段。

Bcl-xl是腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡的過(guò)程中抗凋亡的重要物質(zhì)。大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注后,發(fā)揮主要抗凋亡作用的蛋白是 Bcl- xl蛋白而非 Bcl-2。Merry等的研究提示,Bcl-xl具有結(jié)合凋亡蛋白酶激活因子-1而阻止凋亡小體形成的作用,因此 Bcl-xl的高表達(dá)可抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡[2]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在因腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡的過(guò)程中 Bcl-xl蛋白具有重要的作用。與 Bcl-xl同屬一個(gè)基因家族的 Bax作用卻與 Bcl-xl截然不同,全腦缺血后,BaxmRNA與蛋白質(zhì)主要在神經(jīng)元死亡最嚴(yán)重的 CA1區(qū)表達(dá)且發(fā)生在遲發(fā)性細(xì)胞凋亡前,而在缺血損傷的非敏感區(qū)CA3區(qū)卻無(wú)表達(dá)。CA1區(qū) Bax的選擇性表達(dá)表明:通過(guò)獨(dú)立機(jī)制或與 Bcl-2家族其它成員形成雜二聚體機(jī)制,Bax參與了調(diào)控 CA1區(qū)神經(jīng)元在腦缺血后的凋亡[3]。Bax可能對(duì)腦缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡起促進(jìn)作用[4]。另有研究顯示 ,Bax與線粒體膜上的 Bcl-2和 Bcl-xl結(jié)合,減弱其凋亡抑制作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:局灶性腦缺血后再灌注前進(jìn)行后處理,缺血后處理組各時(shí)間點(diǎn) Bcl-xl蛋白的表達(dá)明顯高于缺血再灌注組,Bax蛋白表達(dá)明顯低于缺血再灌注組。提示腦缺血后處理可以減少腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,缺血后處理減少腦缺血再灌注損傷的機(jī)制與其減少細(xì)胞凋亡的作用有關(guān),這與 Zhao[6]等對(duì)腦缺血后處理后凋亡標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果相符。

缺血預(yù)處理是在腦缺血之前給予的數(shù)次短暫再灌注/缺血的循環(huán),臨床上,可操作性較低;而缺血后處理是在腦缺血發(fā)生后再灌注之前進(jìn)行,臨床上可在腦梗死后溶栓之前操作,這克服了缺血預(yù)處理的弊端。故對(duì)缺血后處理的研究,特別是其具體操作的研究,有著重要而深遠(yuǎn)的意義。

[1]賈麗娜,宋友,程洪斌.缺血后處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注大鼠 SOD、MDA的影響 [J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2011,25(9):1049-1051

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