沈建芬，張又枝，肖軍花，王嘉陵

(1.浙江省嘉興市第一醫(yī)院，314000;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，武漢430030)

二苯乙烯苷(2，3，5，4＇-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)是從何首烏中提取的活性成分，與人工合成的雌激素己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)及從法國(guó)紅葡萄酒中提取的白藜蘆醇(resveratrol，RES)具有相同的多羥基二苯乙烯結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DES和RES均可通過上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，增加一氧化氮(nitricoxide，NO)產(chǎn)量，產(chǎn)生舒張血管的作用[1-2]。筆者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，THSG具有舒張血管作用，且與增加血管NO產(chǎn)量有關(guān)[3-4]。因此推測(cè)

THSG增加NO產(chǎn)量產(chǎn)生舒張血管的作用可能與影響eNOS基因表達(dá)水平有關(guān)。筆者在本實(shí)驗(yàn)中研究THSG對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)NO含量及eNOS活性的影響及其作用機(jī)制，以期從基因水平闡述THSG增加NO產(chǎn)量、舒張血管的作用機(jī)制，為THSG的開發(fā)利用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料THSG(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系王嘉陵教授提供)，HUVECs(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供)，胰酶(購(gòu)自Sigma公司，批號(hào):9002077)，NO試劑盒(硝酸還原酶法)及NOS分型試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司。達(dá)爾伯克改良必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco＇s modified minimal essential mediun，DMEM)及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于Gibco公司。RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司。eNOS及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物合成為北京奧科公司。eNOS多克隆抗體及actin一抗購(gòu)自Chemclo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組HUVECs用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組加入1，10，100 μmol·L－1THSG(用DMEM配制，過濾除菌)，對(duì)照組不加其他試劑，均用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液在二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組重復(fù)3次，取平均值。

1.3 HUVECs細(xì)胞上清液NO含量及eNOS活性的測(cè)定操作步驟嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，721分光光度儀檢測(cè)吸光度(A)值。

1.4 RT-PCR檢測(cè)HUVECs eNOS mRNA表達(dá)水平總RNA抽提按照總RNA抽提試劑盒說明操作，A260/A280為1.8～2.0，取總RNA 1 μg，按照一步法RT-PCR試劑盒說明操作。eNOS引物序列正義:5＇-TCCTGTATGGCTCCGAGACC-3＇，反義:5＇-AGCAGGAGATGCTGTTGAAGC-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物291 bp。GAPDH引物序列正義:5＇-GTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3＇，反義:5＇-CACGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物555 bp。RT-PCR條件:50℃30 min逆轉(zhuǎn)錄，94℃5 min預(yù)變性，然后94℃40 s變性，57℃40 s退火，72℃30 s延伸，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行密度掃描，以eNOS/GAPDH灰度值計(jì)算待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western Blot檢測(cè)HUVECs eNOS蛋白表達(dá)HUVECs蛋白提取液經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法調(diào)整至相同濃度，以50 μg·L－1上樣，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維膜用含5%脫脂奶粉封閉液封閉，此后分別加入eNOS兔抗一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，TTBS漂洗，加入二抗(1∶1 000稀釋)孵育，再以PBST液振蕩洗滌(15 min×3次)，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠定量軟件Quantity One 4.52分析，以actin作內(nèi)參照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THSG對(duì)HUVECs NO含量及eNOS活性的影響 各濃度THSG均使NO含量增加，使eNOS活性增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)，且隨著濃度增加，作用增強(qiáng)，具有濃度依賴性，見表1。

表1 4組HUVECs NO含量與eNOS活性測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of the content of NO and eNOS activity in 4 groups of HUVECs ±s

表1 4組HUVECs NO含量與eNOS活性測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of the content of NO and eNOS activity in 4 groups of HUVECs ±s

與對(duì)照組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01Compared with control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

NO/eNOS/組別含量(μmol·g－1)活性(U·mL－1)

2.2 THSG對(duì)HUVECs eNOS mRNA表達(dá)的影響THSG可增強(qiáng)eNOS mRNA表達(dá)，且呈濃度依賴性。孵育24 h后，1 μmol·L－1THSG可使eNOS mRNA水平增加(P＜0.05);10 μmol·L－1THSG使eNOS mRNA水平顯著增加，平均吸光度為對(duì)照組的2.2倍(P＜0.01)，結(jié)果見圖1。

2.3 THSG對(duì)HUVECs eNOS蛋白表達(dá)的影響THSG可增強(qiáng)eNOS蛋白表達(dá)，且呈濃度依賴性。孵育48 h后，1 μmol·L－1THSG可使eNOS蛋白水平增加(P＜0.05)。10 μmol·L－1THSG使eNOS蛋白水平顯著增加，平均灰度值為對(duì)照組的2倍(P＜0.01)，結(jié)果見圖2。

3 討論

NO是一種半衰期很短的自由基分子，在許多生物反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，信使作用最經(jīng)典的例子是在血管壁，NO從上皮細(xì)胞彌散到血管壁平滑肌細(xì)胞，激活此處的鳥苷酸環(huán)化酶，引起血管平滑肌細(xì)胞松弛，血管舒張，還可以抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和血小板聚集，影響血流等[5]。正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞可持續(xù)合成和釋放NO，調(diào)節(jié)血管張力。NOS是NO合成的限速酶，在體內(nèi)，內(nèi)源性NO是由NOS催化L-精氨酸(L-Arg)轉(zhuǎn)化而成，其合成與降解之間的平衡由L-Arg-NO通路的活性決定。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)型(nNOS)與誘導(dǎo)型(iNOS)3種類型NOS[6]。eNOS主要分布在內(nèi)皮組織，負(fù)責(zé)基礎(chǔ)NO的合成，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO的量受酶活性和(或)eNOS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[3]，激動(dòng)劑誘導(dǎo)的鈣離子(Ca2+)依賴的eNOS活性快速而短暫的增強(qiáng)，可使內(nèi)皮細(xì)胞迅速產(chǎn)生NO，NO含量于數(shù)分鐘內(nèi)即達(dá)高峰[7]。在生理狀態(tài)下eNOS表達(dá)處于低水平，但可受多種因素調(diào)節(jié)，包括血流動(dòng)力學(xué)、低氧、雌激素等[8]。

THSG與人工合成的雌激素己烯雌酚具有相似的結(jié)構(gòu)，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)體外血管eNOS活性，增加血管NO含量，舒張血管等。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道[9]，THSG能提高動(dòng)脈硬化大鼠NO含量及主動(dòng)脈NOS表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，THSG能增強(qiáng)HUVECs中NO含量和eNOS活性，上調(diào)eNOS mRNA和蛋白表達(dá)，并呈濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)中1，10，100 μmol·L－1THSG孵育24～48 h所引起的HUVEC mRNA和蛋白表達(dá)增多，提示THSG可通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS mRNA和蛋白表達(dá)，增加NO含量，從而產(chǎn)生舒張血管平滑肌作用。

總之，THSG可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA和蛋白表達(dá)，這可能是THSG增加NO量，舒張血管平滑肌的機(jī)制之一。

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