張 志，王賽賽，李 嵐，李 蕾，劉 爽，張艷霞，鄭 輝，吳發(fā)興，李曉成，黃保續(xù)

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 2660322；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州 350002；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）

近年來，我國(guó)生豬的年存欄量和出欄數(shù)居世界首位，一直保持著世界養(yǎng)豬總量的50%左右，在養(yǎng)豬業(yè)取得巨大成就的同時(shí)，還存在諸多制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的因素，特別是疾病已經(jīng)成為最主要的制約因素。據(jù)調(diào)查，每年因疾病死亡造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元。

一些常見傳染病還沒有完全控制，新的傳染病又不斷涌入，所以導(dǎo)致豬群大量存在多種病原的混合感染。既有病毒與病毒之間的混合感染，又有病毒與細(xì)菌之間以及細(xì)菌與細(xì)菌之間的混合感染。這使得豬群發(fā)病后的臨床癥狀復(fù)雜，發(fā)病率和死亡率升高，由于缺乏有效的診斷和監(jiān)測(cè)手段，配套措施不力等原因，豬群疫病的診斷和防治難度加大。

為有效防控豬病，國(guó)家急需豬群疫病相關(guān)的數(shù)據(jù)。從2006年開始，我中心監(jiān)測(cè)室陸續(xù)對(duì)我國(guó)部分省市的豬群開展了一系列的疫病監(jiān)測(cè)，取得了較好結(jié)果，但也遇到了一些問題，如采樣不便等。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷和檢測(cè)大多采取剖檢動(dòng)物，然后取得相應(yīng)組織臟器進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，這種采樣和檢測(cè)的前提是必須要把動(dòng)物處死，因此用于生產(chǎn)上的臨床應(yīng)用時(shí)就顯得相當(dāng)不便。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有不少關(guān)于用活動(dòng)物的全血進(jìn)行病原檢測(cè)的報(bào)道，如PRRSV、PCV2等病原的檢測(cè)，但是至今還未見大規(guī)模使用全血進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的報(bào)道和做法。

為此，我們監(jiān)測(cè)室在多年開展流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上，采用了采集豬全血進(jìn)行多種豬病原的流行病學(xué)檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)，該方法采樣方便，操作簡(jiǎn)單，為順利開展流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)提供了一條新的思路和做法。

1 材料和方法

1.1 豬抗凝全血 2008和2009年，分別從我國(guó)華東、華北、東北、西南和華中等區(qū)域10省的規(guī)模豬場(chǎng)采集1 389份豬全血，采豬血時(shí)加入肝素鈉抗凝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒DNAzol Reagent、RNA提取試劑盒TR Izol購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶AMV、Taq酶購(gòu)自TakaRa公司，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.3 豬全血核酸的提取 每一份豬全血分別都進(jìn)行RNA和DNA的提取。

豬全血RNA的提?。喝∝i全血樣品250 μL于1.5 mL的離心管中，加入750 μL TRIZOL（Invitrogen公司），混勻，室溫放置5 min；再加入200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置10 min；12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清500 μL，加等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇室溫靜置10 min或-20 ℃靜置30 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC處理水配制），8 000~9 000 g離心5 min；棄上清，倒置風(fēng)干，用20 μL DEPC處理水或RNase Free H2O溶解，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

豬全血DNA的提取：取豬全血100 μL于1.5 mL的離心管中，加入1 mL DNAZol，倒置混勻，室溫放置3 min，10 000 g離心10 min；上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入550 mL無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置5 min，6 000 g離心5 min；沉淀用1 mL 75%的酒精洗滌兩次；最后用40 μL的NaOH溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物和檢測(cè)方法 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1-6]，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的檢測(cè)引物，CSFV、PRRSV、BVDV和JEV等病毒的檢測(cè)采用RT-PCR方法，PRV和PCV2等病毒的檢測(cè)采用PCR方法，CSFV、PRRSV、BVDV、PRV、PCV2、JEV等病原的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的大小預(yù)期為272 bp、773 bp、360 bp、632 bp、404 bp和1 015 bp。

1.5 RNA病毒的檢測(cè)

cDNA的制備：種豬精液提取RNA后，分別用PRRSV、CSFV、BVDV和JEV的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，同時(shí)用我實(shí)驗(yàn)室已有的陽性病毒作為陽性對(duì)照。cDNA反應(yīng)體系為：RNA 5μL，dNTP 4 μL，5×AMV Buffer 4 μL，反轉(zhuǎn)錄引物（25pM）1 μL，AMV 0.5 μL，HPRI 0.5 μL，加入適量DEPC水，總體積為20 μL。42 ℃恒溫水浴鍋中水浴1.5 h，取出后放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：分別取PRRSV、CSFV、BVDV、JEV等病毒反轉(zhuǎn)錄的cDNA 2.0 μL作為模板，加入10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTPs（10 mmol/L）2 μL，分別加入PRRSV等相應(yīng)病毒特異性的引物P1和P2各0.5 μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL混勻后采用如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 1min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。BVDV和CSFV則進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，取上述PCR產(chǎn)物1 μL，用引物P3和P4進(jìn)行二次擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 DNA病毒的檢測(cè) 每一份種公豬精液提取的

DNA樣品均進(jìn)行PRV和PCV2的檢測(cè)，即每一份DNA分別用PRV和PCV2的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，取提取的DNA樣品2 μL，加入10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（10mmol/L）2 μL，引物P1和P2各0.5 μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL混勻后采用如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.7 電泳 取10 μL RT-PCR和PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察有無特異性條帶。

2 結(jié)果

2.1 豬全血中幾種病毒PCR擴(kuò)增情況 PCR或者RTPCR結(jié)束后進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中，PRRSV、CSFV、PRV和PCV2、BVDV和JEV的特異性引物都可以從部分樣品中擴(kuò)增出大小約773 bp、272 bp、632 bp、404 bp、360 bp和1 015 bp的特異性條帶，與已知的陽性病毒結(jié)果一致，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出特異性的條帶，這說明檢測(cè)的樣品中含有PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、BVDV和JEV。（圖略）

2.2 2008年豬全血中幾種病原的檢測(cè)情況 2008年，共從華北、華中和華東地區(qū)的3省8個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)采集了439份豬全血樣品，分別進(jìn)行了PRRSV、CSFV、PRV、PCV2和BVDV的檢測(cè)，陽性率平均為15.0%、61.7%、10.3%、24.4%和2.51%，沒有進(jìn)行JEV的檢測(cè)。三個(gè)區(qū)域中，華北地區(qū)CSFV的陽性率最高，為22.3%；華東地區(qū)的PRRSV、PRV、PCV2和BVDV的感染率均為最高，分別為72.6%、22.6%、62.9%和8.1%。詳見表1。

表1 2008年部分地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)全血樣品病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3 2009年豬全血中幾種病原的檢測(cè)情況 2009年，除華北、華中和華東地區(qū)之外，我們又從東北和西北地區(qū)等省的規(guī)模豬場(chǎng)采集了950份豬全血樣品，分別進(jìn)行了，PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、BVDV和JEV的檢測(cè)，陽性率平均為19.8%、13.7%、1.1%、31.9%、0.7%和2.7%。五個(gè)區(qū)域中，華北地區(qū)CSFV的陽性率仍最高，為18.9%；東北地區(qū)PRRSV和PRV的感染率最高，分別為27.9%和3.2%；華北地區(qū)PCV2感染率最高，為37.5%；東北、華北和西北地區(qū)均沒有檢測(cè)到JEV；東北和華中地區(qū)沒有檢測(cè)到BVDV。從表2中可以看出，PRV的感染率比較低，盡管由于某些原因沒有對(duì)華北和西北地區(qū)的樣品進(jìn)行PRV的檢測(cè)，但從華東和華中地區(qū)JEV的檢測(cè)結(jié)果來看，二者的感染率均為0。詳見表2。

表2 2009年部分地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)全血樣品病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來，我國(guó)豬群的疫病呈現(xiàn)高發(fā)、多發(fā)、混合發(fā)生的特點(diǎn)，一頭豬往往可以感染多種病原。本研究通過對(duì)豬群血液進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)2008年，我國(guó)部分地區(qū)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和BVDV的陽性率平均為15.0%、61.7%、10.3%、24.4%和2.51%，2009年，我國(guó)部分地區(qū)CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、BVDV和JEV的檢測(cè)，陽性率平均為13.7%、19.8%、1.1%、31.9%、0.7%和2.7%，不同地區(qū)之間存在顯著差異。這一結(jié)果與鞠厚斌等2006—2009年對(duì)上海地區(qū)病死豬的主要病毒感染狀況的調(diào)查結(jié)果類似，他們也發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)CSFV、PRRSV、PRV和PCV2病料中不同程度地存在這4種疫病的混合感染，而且其檢出率分別為21.01%、25.33%、31.84%和42.93%，其中PRV的檢出率比本文高[7]。張秀娟[8]采用PCR方法檢測(cè)采集的臨床發(fā)病豬病料，對(duì)山東省中小養(yǎng)豬場(chǎng)中的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病2型和豬流感等5種豬主要疫病的流行狀況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明2006年5種疫病的陽性率分別為35.47%、34.72%、12.46%、33.58%和14.72%；2006—2008年各年混合感染率分別為24.91%、27.99%、20.20%。這些結(jié)果都說明：一是病原的多重感染已經(jīng)成為豬群疫病的主要特點(diǎn)，而且感染的疫病種類主要是豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征以及豬圓環(huán)病毒；二是我國(guó)豬群中存在了牛病毒性腹瀉病毒的感染，其來源和在豬群中的危害應(yīng)引起人們的重視和關(guān)注。

不同病原的特性決定了病原在動(dòng)物組織內(nèi)的分布呈現(xiàn)差異性，不同組織內(nèi)不同病原的含量不同，因此，如何選擇采樣部位非常重要。血液作為一種比較易獲取的樣品一直受到獸醫(yī)工作者的青睞，根據(jù)動(dòng)物流行病學(xué)的研究表明，在常見的幾種豬病中，豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬繁殖障礙綜合征病毒、牛病毒性腹瀉病毒等病原均可以在豬血液中長(zhǎng)期存活，提示可以通過血液檢測(cè)上述幾種病原。國(guó)內(nèi)多年來已經(jīng)使用商業(yè)化的試劑盒直接對(duì)血液中的豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，國(guó)外Qiang L等[9]對(duì)豬血清中的PCV進(jìn)行檢測(cè)，正常表現(xiàn)的豬可以檢測(cè)到50%的陽性率。MacDonald等[10]從171份血清中進(jìn)行PCV的檢測(cè)，首先利用血清學(xué)方法從中檢測(cè)出28份抗體陽性（滴度大于16），然后利用PCR方法從這28份血清中檢測(cè)到13份病毒DNA陽性，隨后從這13份血清中分離到9株P(guān)CV，這說明用血液進(jìn)行PCV病毒的檢測(cè)是可行有效的。本文對(duì)1 389份全血進(jìn)行的病原檢測(cè)也充分證實(shí)了我們這一推測(cè)的可行性。因此，在對(duì)上述幾種疫病進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，可以采集血液送檢，這將極大方便開展流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)工作。

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