溫建軍，徐雪芳

（1.江西省贛州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西贛州 341000；2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206）

1 EIEC的危害

腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E.coli，EIEC）是一種能引起較大兒童和成年人腹瀉的重要病原菌，最早是由DuPont于1971年首先發(fā)現(xiàn)[1]。EIEC的致病毒力強，只要10~100個細菌即可發(fā)病。臨床上EIEC的癥狀主要是水樣腹瀉，少數(shù)人出現(xiàn)痢疾癥狀，暴發(fā)的感染源通常是食物源性或水源性的，也可以接觸傳播，形成散發(fā)病例[2]。本文主要就目前國內(nèi)外EIEC的致病因子和致病分子機制研究進展情況進行了介紹。

2 致病菌EIEC的血清鑒定研究

致病菌EIEC引發(fā)疾病，首先對其進行血清分型鑒定，以確認是EIEC引起的。EIEC血清分型系統(tǒng)最早由Kauffman scheme在1947年創(chuàng)立[3]。 大腸桿菌的血清分型根據(jù)三種表面抗原。包括O性表面抗原（外膜O特異性脂多糖），鞭毛抗原（H）和被膜抗原（K）[4-5]。到目前為止，一共分離到170種O抗原，每一種都代表一個血清組。每個血清型都由特異的O和H抗原組成。表1中列舉了目前分離到的大部分腸侵襲性大腸桿菌的血清型。

表1 目前分離到的EIEC血清型

3 EIEC的致病機制研究

大腸桿菌致病性主要決定于毒力因子，致病性大腸桿菌上存在很多致病因子，主要有菌毛、毒素、粘附素、侵襲因子、溶血素等，這些毒力因子通常是由染色體上成簇存在的一組基因所編碼，稱之為毒力島（pathogenicity island，PAI）[6]。目前有關(guān)EIEC毒力島與致病性的關(guān)系、致病的分子機制已經(jīng)成為當今的研究熱點。

3.1 EIEC的毒力因子研究

根據(jù)目前國外的相關(guān)研究，與EIEC致病相關(guān)的毒力因子已經(jīng)被鑒定出來，主要有如下幾類：粘附素系統(tǒng)[7]（菌毛、非菌毛黏附素、F1、P、F17、）、鐵離子攝取系統(tǒng)[8-9]（氣桿菌素、腸桿菌素）、抗機體殺菌因子[10]（外膜蛋白A、脂多糖、KI莢膜、耶爾森菌素、增強血清中生存蛋白）。

3.1.1 粘附素系統(tǒng)

黏附素是一類表達與細胞膜表面長約0.5~3微米，在電鏡下呈絲狀的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通常多達100個相同的結(jié)構(gòu)亞單位和各種不同的微小輔助蛋白構(gòu)成，因而在體內(nèi)外試驗中能接到細菌吸附于有些細胞上而得名。EIEC擁有特異的粘附因子，這些粘附因子促使桿菌完成對宿主粘膜細胞起始的定居[7]。大部分情況下，這些粘附因子會形成叫作菌毛的明顯的形態(tài)學結(jié)構(gòu)，菌毛有好幾類。有的菌毛為桿狀結(jié)構(gòu)，直徑為5~10 nm，與鞭毛有明顯不同。而有些菌毛直徑大部分為2~4 nm，呈長的絲狀或卷曲有彈性型。

3.1.2 鐵離子攝取系統(tǒng)

鐵離子對所有生存著的微生物來說是必需的營養(yǎng)成分，并且作為基本酶反應體系的成分，參與有氧代謝、電子專用過程、DNA或RNA的合成。但環(huán)境中的鐵是以不溶的礦物質(zhì)形式存在的，動物體內(nèi)的鐵則與鐵結(jié)合蛋白緊密結(jié)合，因此，細菌環(huán)境中游離鐵的濃度非常低（10-12mol/L）不能滿足細菌生長繁殖的需求10-7mol/L）。為了在一個限鐵的環(huán)境中生存和繁殖，大腸桿菌特異性的建立起高親和性的鐵攝取系統(tǒng)，通過釋放稱作鐵載體的小分子物質(zhì)來應對許多缺鐵性的生長環(huán)境，然后他們能利用特異性的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)再攝取這些螯合了鐵的鐵載體[8]。大腸桿菌的攝取鐵離子系統(tǒng)的機制主要包括產(chǎn)生鐵結(jié)合性復合物和溶血素。鐵結(jié)合性復合物包括羥偶基/氣桿菌素（Hydroxymate/aerobactin）和酚鹽/腸桿菌素（phenolate/enterobactin）。氣桿菌素為含一個或多個氧化型肽鍵的復合蛋白，由質(zhì)粒編碼。腸桿菌素為含一個或多個2，3-二羥基苯基團的復合物，由染色體編碼。相較而言，氣桿菌素比腸桿菌素更適合于從血清中攝取鐵。而且與腸桿菌素不同的是，氣桿菌素在將運載的鐵釋放入細胞內(nèi)后，還可循環(huán)利用。溶血素可能是一種輔助毒力因子。細菌的溶血性往往與其毒力平行，有溶血性的毒株毒力較強，溶血后產(chǎn)生足夠的鐵離子以供細菌生產(chǎn)，有利于侵入性感染[9]。

3.1.3 抗機體殺菌因子

由質(zhì)粒編碼的外膜蛋白（OMP）有助于細菌對宿主細胞的吸附并有助于細菌逃逸機體免疫防御，最后外膜蛋白可作為運鐵產(chǎn)氣桿菌素的受體協(xié)助將鐵攝入細胞內(nèi)，有利于細菌在低鐵環(huán)境下生長、繁殖。脂多糖（LPS）與OMP存在一定的關(guān)系，研究表明，LPS是OMP A蛋白作為TuⅡ受體所必需的，OMP免疫伴隨LPS抗體的產(chǎn)生同時產(chǎn)生[10]。

3.2 分子致病機制（遺傳基因?qū)W）

EIEC的毒力因子通常都由可變性的、可以用來重組形成新菌株的基因原件或曾經(jīng)為可變性的基因元件而已被重組為基因組的基因元件所編碼，并且在宿主內(nèi)能將致病性毒力因子與基因組重組產(chǎn)生突異性的致病性菌株才能成功存活下來，而控制這些毒力因子的基因可以由染色體以外的基因（如質(zhì)粒）編碼，也可以是染色體上的某些特殊片段[11]。因此，完整的EIEC毒力涉及到一套編碼在質(zhì)粒和染色體上的基因，主要有由毒力質(zhì)粒和編碼在染色體上his（組氨酸）、kcp（豚鼠角膜結(jié)膜炎）、ha-xyl（鼠李糖-木糖）、ldc（賴氪酸脫援酶）等基因片段。

3.2.1 編碼在染色體以外的毒力因子基因

EIEC的侵襲力是由質(zhì)?？刂频?，質(zhì)?？赊D(zhuǎn)移給無毒力菌株，消除質(zhì)粒，桿菌即喪失其侵襲力[11]。侵襲包括原發(fā)和擴散兩個過程。Sansonetti和Harris等先后證實EIEC的侵襲性質(zhì)粒分子量為120~140 Md[12-13]，該質(zhì)?？删幋a15種以上外膜蛋白，可控制多種毒力因子，其中有6~7種是與侵襲力有關(guān)的外膜蛋白，并可產(chǎn)生完全抗體。組侵襲性外膜蛋白（Ipa）為大質(zhì)粒所共有．它們是IpaA（78 kd）、IpaB（57 kd）、lpaC（43 kd）、lpaD（57 kd）， 受 質(zhì) 粒DNA37 kd的EcoRI酶切點控制．該序列中尚有二個EcoRI酶切點．產(chǎn)生76、118和17 kd三個攻級片斷段．而這三個次級片段均不能單獨表達對Hela細胞的侵入功能，只有按固定順序結(jié)合在一起方可表現(xiàn)侵入特性，進而證明這三個片段與侵襲基因相關(guān)。

組侵襲性外膜蛋白Ipa由EIEC復雜針管狀組織的III型分泌系統(tǒng)所產(chǎn)生，起介導上皮細胞信號傳導、改變細胞膜結(jié)構(gòu)、溶解細胞內(nèi)空泡等作用[14]。III型分泌裝置能使帶有微孔結(jié)構(gòu)的IpaB和IpaC插入到宿主細胞膜。IpaA則能誘導肌動蛋白脫聚合，與IpaC協(xié)同作用，共同促使EIEC侵入宿主細胞。IpaB除形成微孔外，還能結(jié)合信號蛋白，改變細胞結(jié)構(gòu)，并能與巨噬細胞caspase-1結(jié)合，誘導細胞凋亡和IL-1的釋放。IpaC具有誘導肌動蛋白聚合功能，引起細胞延長。IpaD是轉(zhuǎn)移效應因子，有4-肌醇磷酸激酶活性，通過打開細胞漿膜與細胞骨架肌動蛋白連接，在細胞膜上形成泡狀結(jié)構(gòu)，從而改變宿主細胞的形態(tài)。Ipa抗體有被動免疫保護性作用，可阻斷EIEC侵入上皮細胞．而E1EC脂多糖抗體沒有上述的阻斷作用，說明lpa在抗感染過程中起重要作用。

此外，EIEC的毒力質(zhì)粒上還編碼一種E蛋白，它能結(jié)合剛果紅染料（copgo red），為剛果紅試驗陽性（Cr+），無毒株則為Cr-。Cr基因和質(zhì)粒上的毒力基因VirF片段椰注。Cr基因轉(zhuǎn)給E.coil，E.coil可以變成Cr。Cr基因位于BamHI和EcoRI的45 kb片段內(nèi)。它的表達也受培養(yǎng)溫度的調(diào)節(jié)。除此之外，140 Md質(zhì)粒上還能編碼細胞結(jié)合溶血素或稱接觸性溶血素。其功能還不十分清楚，僅知它與細菌在細胞內(nèi)逃避胞內(nèi)空泡的吞噬和向鄰近細胞擴散有關(guān)。EIEC的毒力與志賀菌毒力一樣不穩(wěn)定，主要是質(zhì)粒易丟失，一旦丟失EIEC就喪失致病力。

3.2.2 編碼在染色體上的毒力因子基因

毒力島是位于細菌染色體上成簇分布的編碼毒力相關(guān)基因的片段，該片段是一大的具有流動性的特定區(qū)域，可能是通過噬菌體介導的水平轉(zhuǎn)移所獲，是賦予細菌致病性和毒力的重要因素之一，它最初是由德國微生物學家Hacker及其同事在研究泌尿道大腸桿菌UPEC536與J96菌株遺傳基礎時提出來的，隨后人們發(fā)現(xiàn)許多病原微生物中存在毒力島。

毒力島相對分子質(zhì)量大、編碼許多與毒力相關(guān)的基因，其兩側(cè)具有重復序列、整合酶位點和插入元件，G+C mol%和密碼使用與其宿主菌有明顯差異、具有不穩(wěn)定性；毒力島常位于染色體的tRNA位點內(nèi)或附近，或者位于與質(zhì)粒、噬菌體整合有關(guān)的位點，毒力島編碼的基因產(chǎn)物多為分泌性蛋白和細胞表面蛋白，如溶血素、菌毛、血紅素結(jié)合因子等；一些毒力島編碼細菌的分泌系統(tǒng)（如III型分泌系統(tǒng)）、信號傳導系統(tǒng)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)等[10]。目前在致病性大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的毒力島主要有：耶爾森菌強毒力島（The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI）、腸細胞脫落位點（Locus of enterocyte effacement，LEE）毒力島和OI毒力島等。耶爾森菌HPI廣泛分布于腸道致病菌中，主要含有與鐵攝取有關(guān)的毒力基因簇，編碼參與合成及攝取鐵載體耶爾森桿菌素（ yersini-abactin） 的鐵抑制蛋白irp （iron-repressible protein） 基因及其調(diào)控基因，行使鐵攝取功能[8-9]。Schubert等[15]1998年發(fā)現(xiàn)93 %的腸凝集性大腸桿菌、27 %的腸侵襲性大腸桿菌、5%的腸致病性大腸桿菌和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌具有irp2-fyuA 基因簇。目前多數(shù)研究表明，耶爾森菌HPI的相對不穩(wěn)定性與其在腸道桿菌不同種屬間的廣泛分布，是通過毒力島基因水平轉(zhuǎn)移獲得的，毒力島的水平轉(zhuǎn)移機制主要包括毒力島的刪除和整合機制。耶爾森菌HPI兩側(cè)含有整合酶、正向重復序列IS100等與同源重組有關(guān)的位點，這些基因在整合和刪除時發(fā)揮重要的作用。毒力島基因水平的轉(zhuǎn)移是桿菌等致病性大腸桿菌進化的原動力之一，它參與了腸道致病菌遺傳上質(zhì)的飛躍的進化過程，從而促進宿主菌的新陳代謝，更能適應外周環(huán)境和宿主環(huán)境，增強其致病性。

不論毒力島在供體菌中的結(jié)構(gòu)如何完整，轉(zhuǎn)移機制如何完善，毒力島在轉(zhuǎn)移到宿主菌后還是會發(fā)生基因片段的缺失，這些缺失可能是宿主菌為適應周圍不同的環(huán)境而導致的。

4 EIEC的病原學檢測與鑒定

通常很難把EIEC與志賀氏菌和其他非致病性大腸桿菌分離開。傳統(tǒng)的方法是采用血清型鑒定，生化試驗和Sereny試驗。Sereny試驗的原理是利用EIEC可以侵入上皮細胞和在細胞間傳播的能力進行鑒定[16]。由于傳統(tǒng)方法在操作上比較復雜，目前報道有兩種多聚核酸探針的方法來鑒定EIEC和志賀氏菌。其中之一是pMR17，這是從志賀氏菌血清型5中分離到的pInv質(zhì)粒上得大小為17 kb的ECorI片段[17-18]。另外一種多聚核酸探針是ial，這是從EIEC分離到的pInv質(zhì)粒上得大小為2.5 kb的HindIII 片段。這兩種探針對EIEC都有100%的敏感性和特異性。另外針對ial的21 bp的引物與多聚探針具有相似的敏感性和特異性[19]。Pal等建立了檢測ipaC基因的ELISA方法，ipaC基因位于EIEC和志賀氏菌的Inv質(zhì)粒上[20]。采用這種方法，實驗者從由兒童糞便中分離到的菌群中檢測到EIEC和志賀氏菌。這種方法由于其他檢測方法的地方在于它耗費低，而且不需要精密儀器和動物。

5 小結(jié)

EIEC致病是一個多方面因素都參與的最終表現(xiàn)結(jié)果。但是具體的致病機制，目前仍沒有研究得十分透徹和詳細。隨著毒力島的深入研究，人們已經(jīng)認識到是多個毒力因子相互協(xié)同作用，毒力島不僅賦予病原體特殊的致病能力，介導感染過程的特殊階段，而且在桿菌進化過程中扮演著重要的角色。因此，以桿菌致病過程中參與的致病因子作為突破口，解析毒力島的進化機制和調(diào)控機制有助于對EIEC疾病進行更有效的治療和預防，并為控制EIEC疾病提供可靠的理論依據(jù)。

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