汪少蕓， 李曉坤， 周焱富， 吳金鴻

(1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350002;2.上海交通大學(xué)生物與食品學(xué)院，上海 290002)

抗凍蛋白的作用機(jī)制及基因工程研究進(jìn)展

汪少蕓1， 李曉坤1， 周焱富1， 吳金鴻2

(1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350002;2.上海交通大學(xué)生物與食品學(xué)院，上海 290002)

分析了抗凍蛋白的作用機(jī)制及基因工程的研究進(jìn)展.抗凍蛋白是一類具有熱滯效應(yīng)、冰晶形態(tài)效應(yīng)和重結(jié)晶抑制效應(yīng)的蛋白質(zhì).近些年的工作主要集中在該類蛋白質(zhì)抗凍機(jī)制及基因工程的研究上.抗凍蛋白具有廣泛的應(yīng)用前景，它不但可以應(yīng)用于食物的冷鮮貯存及移植器官的低溫保存，還可通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高經(jīng)濟(jì)作物的抗凍能力.

抗凍蛋白;作用機(jī)制;基因工程

抗凍蛋白 (antifreeze protein，AFPs)是一類能控制冰晶生長(zhǎng)和抑制冰晶之間發(fā)生重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，能在結(jié)冰或亞結(jié)冰條件下保護(hù)生物體不受傷害.抗凍蛋白具有兩種明顯不同的活性——熱滯活性和重結(jié)晶抑制活性.抗凍蛋白雖然在氨基酸序列、物種來(lái)源和高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面具有很大差異，但都能通過(guò)吸附作用與特定冰晶表面結(jié)合，從而表現(xiàn)出相應(yīng)的抗凍活性.它或者通過(guò)與冰晶結(jié)合而影響冰晶的形狀及大小來(lái)發(fā)揮作用.基于抗凍蛋白影響冰晶結(jié)構(gòu)的特性，對(duì)抗凍蛋白的最新定義是“Ice structuring protein”，即制約冰晶結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)［1］.生物體細(xì)胞間隙中的抗凍蛋白通過(guò)與冰結(jié)合、修飾冰晶形態(tài)、阻止冰晶進(jìn)一步生長(zhǎng)來(lái)保護(hù)生物體免受凍傷，抗凍蛋白的應(yīng)用除了在低溫保護(hù)、霜凍保護(hù)方面，還可以作為生物礦化的模型［2］.不同來(lái)源的抗凍蛋白無(wú)論結(jié)構(gòu)或活性都存在著很大的差異，其抗凍機(jī)理/學(xué)說(shuō)也不完全一致，闡明抗凍蛋白的作用機(jī)制對(duì)研究者來(lái)說(shuō)仍然是一個(gè)巨大挑戰(zhàn).本文試總結(jié)近年來(lái)對(duì)抗凍蛋白的作用機(jī)制/學(xué)說(shuō)及基因工程的研究進(jìn)展.

1 抗凍蛋白的作用機(jī)制

至今，在魚、昆蟲、植物和細(xì)菌等生物體中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白，按照來(lái)源的不同，抗凍蛋白被分為魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白和細(xì)菌抗凍蛋白［1］.從魚、昆蟲、植物以及細(xì)菌中分離的抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)和組成上具有很大的差別，不同抗凍蛋白的抗凍機(jī)理不完全一致.魚類抗凍蛋白的研究較多，而植物和昆蟲抗凍蛋白的作用機(jī)制研究甚少.

抗凍蛋白能結(jié)合在水和冰的交界面來(lái)抑制冰晶的生長(zhǎng).但不同類型的抗凍蛋白能結(jié)合的冰面類型不同［3］.作為表面活性物質(zhì)，少量AFPs能對(duì)冰的生長(zhǎng)產(chǎn)生巨大影響.AFPs是如何與冰晶結(jié)合的呢?

1.1 吸附抑制學(xué)說(shuō)

吸附抑制學(xué)說(shuō)最早由Raymond和Devires在1977年提出.他們認(rèn)為抗凍蛋白吸附在冰晶表面通過(guò)Kelin效應(yīng)抑制其生長(zhǎng).機(jī)制的模型為:一般晶體的生長(zhǎng)垂直于晶體的表面，假如雜質(zhì)分子吸附于冰生長(zhǎng)通途的表面，那么需要在外加一推動(dòng)力(冰點(diǎn)下降)，促使冰在雜質(zhì)間生長(zhǎng).由于曲率增大，使邊緣的表面積也增加.因表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態(tài)發(fā)生改變，從而冰點(diǎn)降低［4］.抗凍蛋白積累在冰和水的接觸面，通過(guò)改變冰晶的形成和生長(zhǎng)方式來(lái)修飾冰晶生長(zhǎng).

抗凍糖蛋白的二糖鏈上富含羥基，各羥基之間的距離與冰晶a-軸上氧之間的距離吻合;在不含糖的抗凍蛋白中的極性氨基酸距離也恰好吻合.因此判斷，由于抗凍蛋白側(cè)鏈上的氫鍵與冰晶結(jié)合，通過(guò)屏障和覆蓋作用阻止冰晶生長(zhǎng).而很多實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了抗凍蛋白和冰晶之間確實(shí)有氫鍵存在［5］.

新加坡國(guó)立大學(xué)研究人員將小冰晶成核技術(shù)應(yīng)用于AFPⅢ的抗凍機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)AFPⅢ可以吸附到小晶核和塵埃顆粒上，從而阻礙冰晶的成核作用，使之首次從數(shù)量上來(lái)檢測(cè)AFP的抗凍機(jī)制［6］.該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了吸附抑制學(xué)說(shuō)的合理性.

在研究抗凍植物抗凍活性時(shí)，有學(xué)者認(rèn)為抗凍植物形成了一種特殊的控制胞外冰晶形成的機(jī)制，即抗凍蛋白和冰核聚物質(zhì)的協(xié)同作用.在植物體內(nèi)，熱滯效應(yīng)并不明顯，而冰重結(jié)晶抑制效應(yīng)顯著.吸附抑制學(xué)說(shuō)是否適應(yīng)于植物有待進(jìn)一步證實(shí)［7］.

1.2 “晶格匹配”模型

“晶格匹配”模型由DeViles在1983年提出.在“晶格匹配”模型中，冬季比目魚AFP-I的兩親性α螺旋通過(guò)規(guī)律排布，突出螺旋外的Thr和Asx殘基與冰晶棱面相結(jié)合.在這個(gè)特異的冰晶結(jié)合棱面“晶格匹配”模型被鑒定后，發(fā)現(xiàn)該模型似乎也可適用于部分其他的冰晶表面［8］.

加拿大Queen大學(xué)的研究人員利用X射線晶體衍射等方法獲得了TmAFP的晶體結(jié)構(gòu)后，進(jìn)行抗凍機(jī)制的研究，給出的機(jī)制模型為:在TmAFP三棱鏡樣結(jié)構(gòu)的一個(gè)側(cè)面上Thr-Cys-Thr模體重復(fù)出現(xiàn)在每一個(gè)β片層(三角形的邊)中使得Thr在二維空間上排成兩行，并且這兩行Thr上羥基氧之間的距離可以極好地與冰的晶格匹配，它們的緊密結(jié)合阻止了水與冰晶的接觸，從而抑制冰晶的增長(zhǎng)［6］.

1.3 “偶極子-偶極子”假說(shuō)模型

“偶極子-偶極子”假說(shuō)模型由Yang等在1988年提出.該模型認(rèn)為AFPs有顯著平行于其螺旋軸親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的偶極子(dipole).冬季比目魚的AFPⅠ是一種單一的α螺旋，在冰晶中也存在著偶極子.“偶極子-偶極子”假說(shuō)就是AFPⅠ的偶極子與冰核周圍水分子的偶極子相互作用，即螺旋產(chǎn)生的偶極子作為AFPs與冰晶相互作用的特異識(shí)別的起始推動(dòng)力，兩親性的α螺旋經(jīng)親水側(cè)鏈的定位，提供冰格相互作用的氫鍵，而疏水側(cè)鏈則阻止冰晶的生長(zhǎng)［8］.“偶極子-偶極子”假說(shuō)模型很形象地表述了抗凍蛋白和冰晶的作用方式，也為研究抗凍蛋白的作用機(jī)制提供了新思路.

1.4 “晶格占有”模型

“晶格占有”模型由Knight等在1993年提出.該模型是在“晶格匹配”模型基礎(chǔ)上演變而來(lái).“晶格占有”模型中，AFPs中部分氫鍵基團(tuán)通過(guò)“占有”冰晶表面上氧原子的位置，從而與臨近的氧原子同時(shí)形成了多個(gè)氧鍵，這樣就使得氫鍵數(shù)量增加了幾倍，最終導(dǎo)致AFPs冰晶之間形成不可逆結(jié)合［8］.

1.5 氫原子結(jié)合模型

該模型認(rèn)為，AFPs分子一側(cè)相對(duì)疏水，另一側(cè)是親水的，親水一側(cè)與冰相結(jié)合，而疏水一側(cè)與水相作用.從鰻魚(macrozoarces americanus)中提取的AFPⅢ的0.125 nm晶體結(jié)構(gòu)揭示有一明顯兩性冰結(jié)合位點(diǎn)，在那里相連有5個(gè)氫原子和在冰柱面(prism plane)的兩列氧原子相匹配，有很高冰結(jié)合親和性和專一性.每個(gè)AFP分子14個(gè)非丙氨酸側(cè)鏈或有利于與冰結(jié)合，或有利于螺旋的穩(wěn)定性.AFPs在晶體內(nèi)所呈現(xiàn)的精巧的帽子結(jié)構(gòu)大大增強(qiáng)這種穩(wěn)定性.N-末端帽子結(jié)構(gòu)是由8個(gè)氫原子(Asp1，Thr2，Ser4，Asp5 和兩個(gè)水分子的氫)組成的有序網(wǎng).帽子結(jié)構(gòu)內(nèi)部Asp1能增加冰晶與螺旋偶極子作用的穩(wěn)定性.同時(shí)與游離N-端最近的Asp5也可以抵消與螺旋偶極子作用的不穩(wěn)定性變化［9］.

AFPs-冰結(jié)合結(jié)構(gòu)由蘇氨酸/門冬氨酸，蘇氨酸/天冬酰氨/亮氨酸重復(fù)序列組成4個(gè)相似的冰結(jié)合模塊(ice-binding motifs，IBM).IBM殘基牢牢限制形成例外的扁平冰結(jié)合面，對(duì)AFPs-冰結(jié)合群接近影響重大.這關(guān)鍵在于蘇氨酸和天冬氨酸或天冬氨酸之間保守的丙氨酸維持.和冰結(jié)合平面是“嶺-谷”式拓?fù)浣Y(jié)構(gòu).AFPs-冰結(jié)合面相對(duì)扁平和鏈的剛性是AFPs-冰結(jié)合機(jī)制的關(guān)鍵.后者維持AFPs分子結(jié)合的一致性，前者使得AFPs與冰表面結(jié)合的可能性最大.總之，AFPs結(jié)構(gòu)的特征有利于冰的結(jié)合和螺旋的穩(wěn)定性［9］.這正是由于AFPs分子與冰的結(jié)合阻止冰晶生長(zhǎng)，抗凍蛋白作用得以發(fā)揮.

1.6 剛體能量學(xué)說(shuō)

該學(xué)說(shuō)把AFPs分子視為小粒子，因此，根據(jù)界面能量原理可以認(rèn)為AFPs在冰水表面處于平衡位置，并且冰晶的生長(zhǎng)過(guò)程可以用粒子相互作用的理論觀點(diǎn)來(lái)解釋.在這里，重要的參數(shù)是“抗凍蛋白-冰”和“抗凍蛋白-水”界面之間表面能的差異，所用的原則是總表面能最小原理.因此，即使兩種界面表面能一樣，AFPs分子與冰水無(wú)優(yōu)先結(jié)合，當(dāng)抗凍分子存在時(shí)，由于冰-水表面積縮減，AFPs也能強(qiáng)烈吸附冰晶.另外，AFPs必須與冰晶相匹配，否則水分子就會(huì)擴(kuò)散至界面，隨著冰晶的增長(zhǎng)同時(shí)使蛋白向前推進(jìn)，水分子在粒子后擴(kuò)散，推進(jìn)粒子向前，在溶液中形成冰晶體.通過(guò)這種方式，即使超過(guò)過(guò)冷卻溫度1℃或更小，也會(huì)產(chǎn)生很大的壓力.在有AFPs的溶液中，因?yàn)橐幌盗械目箖龅鞍追肿佑谰眯缘劐^定于冰上，所以它們就不可能被向前推進(jìn).這樣，只有當(dāng)過(guò)冷卻水足以吞沒(méi)AFPs分子時(shí)，冰晶才能形成.這就有效地阻止冰晶的形成［9］.

1.7 “表面互補(bǔ)”模型

“表面互補(bǔ)”模型理論是另一種可以較好解釋AFPs抗凍機(jī)理的模型，被稱為“受體-配體”模型，其中AFPs是受體，冰是配體［10］.該理論認(rèn)為，AFPs冰晶結(jié)合位點(diǎn)所形成的表面與冰晶表面互補(bǔ).互補(bǔ)表面受多種相互作用力影響，主要是疏水作用和范德華力，氫鍵起次要作用.較強(qiáng)的表面作用力使AFPs和冰晶形成不可逆的結(jié)合，阻止了冰晶生長(zhǎng)［11］.

該模型成功地解釋了目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有極大差異性的AFPs能與不同形狀的冰晶表面結(jié)合，另一個(gè)原因是冰晶含有許多不同的表面，每個(gè)表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和氧原子間距都不相同，AFPs在與任何一個(gè)冰晶表面結(jié)合后都將阻止冰晶的生長(zhǎng).冰晶就像配體一樣，通過(guò)表面互補(bǔ)選擇性地與不同受體的AFPs結(jié)合，這種表面互補(bǔ)方式可適用于所有AFPs［11］.

加拿大阿爾伯達(dá)大學(xué)的研究人員利用核磁共振方法研究Thr側(cè)鏈的柔韌性時(shí)發(fā)現(xiàn)在接近冷凍溫度時(shí)，在AFPs-冰晶結(jié)合面處的Thr以最適與冰晶表面相咬合的構(gòu)型存在，非結(jié)合面處的Thr以多種構(gòu)型存在.因此得出結(jié)論:規(guī)則的Thr排列使AFPs與冰晶表面緊密吻合，這種形態(tài)互補(bǔ)結(jié)合是抑制冰晶生長(zhǎng)的關(guān)鍵［6］.該結(jié)論證實(shí)了“表面互補(bǔ)”理論.

加拿大Queen大學(xué)的研究人員利用定點(diǎn)突變的方法測(cè)定了AFPⅠ和LpAFP的與冰晶結(jié)合面.結(jié)果表明，改變冰結(jié)合面的氨基酸后，AFPs的抗凍活性大大降低，而改變非結(jié)合面的氨基酸，對(duì)AFPs的抗凍活性影響不大.該結(jié)論進(jìn)一步證明了AFPs和冰晶面的互補(bǔ)性和專一性［12］.

從我國(guó)胡蘿卜栽培品種中克隆的DcAFP的理論三維結(jié)構(gòu)為一個(gè)非常有規(guī)律的右手β螺旋，螺旋的每個(gè)β環(huán)由LRR基序的24個(gè)氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)特征主要為由保守的L(包括I)組成的疏水核心和保守的P和G組成的β轉(zhuǎn)角.在24aa基序中保守N的兩側(cè)為親水性很強(qiáng)的氨基酸密集區(qū)，形成一個(gè)高度親水性表面，與冰晶表面剛好形成不完全互補(bǔ).DcAFP的LRR基序中高度保守的N端對(duì)于維持這個(gè)冰晶結(jié)合表面具有決定性作用［11］.

不同植物AFPs雖在DNA和氨基酸水平上完全不同，幾乎沒(méi)有同源性，但卻擁有相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)，冰晶結(jié)合位點(diǎn)也有一定相似性，都可以通過(guò)“表面互補(bǔ)”模型較好地解釋其與冰晶的相互作用.但植物AFPs的“表面互補(bǔ)”模型存在很多問(wèn)題，如至今無(wú)法確定“表面互補(bǔ)”模型中到底含有多少種作用力，每種作用力的貢獻(xiàn)和作用方式更需進(jìn)一步研究［13］.

1.8 親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型

浙江大學(xué)提出了AFPs在超低溫保存機(jī)制的新模型，即親和相互作用偶聯(lián)團(tuán)聚模型.該模型認(rèn)為抗凍蛋白不僅與冰晶作用，而且又與細(xì)胞膜和冷凍保護(hù)劑中的其他分子發(fā)生親和相互作用.抗凍蛋白在結(jié)合冰晶后所暴露的疏水面能夠與細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生相互作用.事實(shí)上，能夠和抗凍蛋白或抗凍蛋白-冰晶復(fù)合體發(fā)生相互作用的分子廣泛存在.研究表明，Ⅱ型抗凍蛋白是從C類動(dòng)物凝集素的碳水化合物識(shí)別區(qū)演化而來(lái)，后者可結(jié)合細(xì)胞膜上的糖蛋白.體外實(shí)驗(yàn)證明，抗凍蛋白活性可通過(guò)一系列低分子化合物來(lái)增強(qiáng)或減弱.一種含有碳水化合物的細(xì)菌抗凍蛋白，既具抗凍活性，又具冰核活性;去除碳水化合物部分，冰核活性也隨之消失.

當(dāng)抗凍蛋白-冰晶復(fù)合體與其他分子的親和相互作用達(dá)到一定程度時(shí)，抗凍蛋白-冰晶復(fù)合體就團(tuán)聚起來(lái)，從而使冰核變大，表面自由能降低，冰晶生長(zhǎng)被促進(jìn)，抗凍蛋白呈破壞作用;反之，若親和相互作用小，抗凍蛋白-冰晶復(fù)合體不團(tuán)聚，抗凍蛋白僅起到抑制重結(jié)晶的作用，它有利于超低溫保存.按照這個(gè)模型，冷凍保護(hù)劑的組成和濃度，降溫和復(fù)溫速度，抗凍蛋白類型和濃度，最初冰核數(shù)目，以及被凍細(xì)胞表面特征等等，都可能影響了親和相互作用的強(qiáng)烈程度［14］，從而影響了抗凍活性.

2 抗凍蛋白的基因及基因工程研究

2.1 抗凍蛋白的基因研究

研究發(fā)現(xiàn)，AFPs是被多基因家族編碼的.對(duì)魚類AFPs基因的研究比較深入，它們都是串聯(lián)重復(fù)的多基因家族.抗凍糖蛋白(AFGPs)基因序列中結(jié)構(gòu)基因是46個(gè)正向串聯(lián)的同源性片段，每個(gè)片段編碼一個(gè)AFGP和三肽內(nèi)含子.大多數(shù)能夠產(chǎn)生AFPs的生物體內(nèi)并不只有單一的分子結(jié)構(gòu)，而是有一組異源分子同時(shí)具有抗凍活性.Andorfer等從12月份的甲蟲(dendroides canadensis)幼蟲的cDNA文庫(kù)中，分離到了10個(gè)可能的AFP基因，說(shuō)明這種AFP也是由多基因簇編碼的［15］.

有些AFP基因在生物體內(nèi)以多拷貝存在，最多可以達(dá)到100個(gè)以上.經(jīng)研究證明冬鰈單倍體基因中約含40個(gè)AFP基因拷貝.其中2/3是正向串聯(lián)重復(fù)排列，每個(gè)重復(fù)序列中含有一個(gè)AFP基因，幾個(gè)AFP基因的轉(zhuǎn)錄方向均相同;其余1/3也是相連的，但被不規(guī)則的間隔區(qū)分開.紐芬蘭大洋條鱈(macrozoarces americanus)的基因組中約含有150個(gè)拷貝的AFPⅢ基因，狼魚(anarhichas lupus)基因組中也有80～85個(gè)拷貝的AFPⅢ基因，其中含有許多不規(guī)則相連的基因和較大的串聯(lián)重復(fù).

AFPs在生物體內(nèi)的表達(dá)受發(fā)育時(shí)期的調(diào)控或隨溫度和季節(jié)變化的影響而改變，這種特性為生物在冰凍環(huán)境中獲得盡可能多的AFPs提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ).研究證明從夏季到冬季AFPs及其mRNA的量可以成倍地增加.冬季比目魚肝型AFP的mRNA量可以達(dá)到夏季量的幾百倍，腎和鰭中AFP的mRNA量有5～10倍的變化［16］.云杉色卷蛾幼蟲(choristoneura fumiferana)AFP轉(zhuǎn)錄主要受發(fā)育時(shí)期的調(diào)控，而不是受季節(jié)性低溫調(diào)控［17］.

2.2 抗凍蛋白的基因工程研究

AFPs具有抗寒性，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，利用基因工程將AFP基因轉(zhuǎn)入其他生物以使其具有抗凍性一直是科學(xué)研究的一個(gè)重要方向.

2.2.1 魚類抗凍蛋白基因工程

AFPs的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)開始于1986年［18］，F(xiàn)letcher等將北美黃蓋鰈AFPⅠ注入紅鱒魚體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)受試紅鱒魚可耐受到－1.4～1.6℃，且AFP沒(méi)有受體種屬特異性.隨后Fletcher等［19］將北美黃蓋鰈AFPⅠ基因轉(zhuǎn)入南極鮭魚中，長(zhǎng)達(dá)5年的表達(dá)說(shuō)明南極鮭魚能夠正確表達(dá)插入的北美黃蓋鰈AFPⅠ基因，但分泌在血液中AFP前體缺乏必要的酶系統(tǒng)而不能產(chǎn)生成熟的AFP分子.1987年Davies等用葉圓片法將整合在Ti質(zhì)粒上的美洲擬鰈AFPs基因?qū)胗艚鹣?、煙草、油菜中，并獲得了一定的抗凍力［20］.1989年Cutler［21］等用真空透析法將冬比目魚AFP基因?qū)腭R鈴薯、擬南芥和油菜中，使植物自然結(jié)冰溫度降低1.8℃，證實(shí)了轉(zhuǎn)AFP基因可提高植物的抗寒性.1990年 Ceorges［22］合成冬比目魚 AFP基因，構(gòu)建了含35S啟動(dòng)子、AFP基因和 Cat基因(CAT氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶)的載體pGC51，通過(guò)電擊法將該質(zhì)粒導(dǎo)入玉米原生質(zhì)體，經(jīng)CAT分析，AFP和CAT的抗血清蛋白質(zhì)免疫印跡，檢測(cè)到融合肽的產(chǎn)生.1991年Hightower等［23］將極區(qū)魚的AFP基因(cafa3)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草和番茄，據(jù)報(bào)道這種轉(zhuǎn)基因番茄有很強(qiáng)的冷凍耐受性，已進(jìn)行大田實(shí)驗(yàn).1995年金海翎等［24］將構(gòu)建的美洲擬鰈抗凍肽基因表達(dá)載體導(dǎo)入E.coli中，檢測(cè)到了融合基因.AFP基因在原核生物E.coil表達(dá)具有重大意義，可通過(guò)規(guī)?；a(chǎn)的實(shí)現(xiàn)而制作一種高效的生物防凍劑.1997年Wallis等［25］合成 PHA-AFP基因(PHA 植物凝集素)，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)該基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，對(duì)馬鈴薯葉片電解質(zhì)釋放量的分析表明，轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平與冰凍忍耐程度之間存在著相關(guān)性.

2.2.2 昆蟲抗凍蛋白基因工程

越冬昆蟲與魚類相比，面臨著更嚴(yán)峻的冰凍威脅，因此昆蟲AFPs活性比魚類更高.1997年Graham［26］等發(fā)現(xiàn)黃粉甲蟲(tenebrio molitor)AFP 活性比魚類要高100倍.因此很多人開始嘗試將昆蟲AFP基因?qū)胫参镏?，培育抗寒植物新品種.2000年 Liou 和 Graether等［27－28］破譯了兩種昆蟲 AFP 的精確結(jié)構(gòu)，該AFP具有特殊的β-螺旋結(jié)構(gòu)，使有些昆蟲能夠抵抗－30℃，比魚類的AFPs還要有效100倍，這個(gè)發(fā)現(xiàn)將有可能應(yīng)用于開發(fā)高抗寒性植物，并且還可能成為冷凍食品加工業(yè)的突破.2001年Holmberg［29］等采用引物重疊延伸法，將云杉蚜蟲sbwAFP基因組成 CaMV35S-sbwAFP-胭脂堿合成酶融合基因，采用T-DNA雙元載體導(dǎo)入煙草中，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)到sbwAFP的轉(zhuǎn)錄，含AFP組織提取物具有重結(jié)晶抑制效應(yīng)和熱滯效應(yīng).2005年劉忠淵等［30］根據(jù) Genbank中序列人工合成赤翅甲(dendroids canadensis)AFP基因，將其克隆到載體pGEX-4T-1上，構(gòu)建融合表達(dá)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并進(jìn)行原核表達(dá).AFP的生物活性檢測(cè)表明，赤翅甲的抗凍融合蛋白能夠提高細(xì)菌的耐寒能力.

最近幾年多種表達(dá)載體和宿主菌被用來(lái)表達(dá)昆蟲AFPs，酵母表達(dá)系統(tǒng)也被用來(lái)表達(dá)富含二硫鍵的昆蟲AFPs［31］.但是到目前為止還沒(méi)有活性AFPs的高產(chǎn)表達(dá)系統(tǒng)，因此采用基因工程技術(shù)獲取昆蟲AFPs仍是需要解決的問(wèn)題.

2.2.3 植物抗凍蛋白基因工程

低溫冷害不僅會(huì)限制農(nóng)作物的栽種范圍，也會(huì)造成農(nóng)作物減產(chǎn)，利用AFP基因工程是使植物獲得抗寒性最有效的途徑，而率先進(jìn)入該領(lǐng)域的基因?yàn)闃O區(qū)魚類AFP基因.因?yàn)轸~類、昆蟲和植物在分類學(xué)上的關(guān)系遙遠(yuǎn)，外源基因的正確表達(dá)有一定困難，轉(zhuǎn)基因植物中即使表達(dá)了較高濃度的有活性的AFPs，轉(zhuǎn)基因植物可能仍無(wú)抗凍活性.植物內(nèi)源AFPs基因更適合在植物體內(nèi)表達(dá)，因此人們寄希望于植物AFP基因的發(fā)現(xiàn)和利用.

1992年，加拿大 Griffith等［32］首次報(bào)道從經(jīng)過(guò)低溫鍛煉可忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥中發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源性AFPs，標(biāo)志著植物AFPs研究的開始.1998年英國(guó)York大學(xué)Worrall等［33］發(fā)表了胡蘿卜AFP及其基因的論文，標(biāo)志著第一個(gè)植物AFP基因的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于植物抗凍基因工程具有重要意義.他們測(cè)定了胡蘿卜AFP的體外熱滯值及重結(jié)晶抑制活性，將其cDNA連接在表達(dá)載體的雙CaMV35S啟動(dòng)子之后導(dǎo)入煙草，獲得正確表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草勻漿液的熱滯值為0.35℃.胡蘿卜AFP及其基因的發(fā)現(xiàn)，為植物抗寒基因工程注入新活力.1999年，Meyer等［34］用農(nóng)桿菌介導(dǎo)胡蘿卜AFP基因重組子轉(zhuǎn)化擬南芥，誘導(dǎo)一系列低溫調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，使未經(jīng)低溫馴化的植株具有較強(qiáng)抗寒能力.2001年尹明安［35］構(gòu)建成胡蘿卜AFP的植物表達(dá)載體pBAF，為利用其轉(zhuǎn)化番茄、甜椒等作物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

3 結(jié)束語(yǔ)

近期研究中，人們構(gòu)建成不同表達(dá)載體，將胡蘿卜、雪蓮、沙冬青、冬小麥等的AFP基因轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥等，已研究能產(chǎn)生AFPs的植物雖多達(dá)幾十種，但真正被分離純化出來(lái)的AFPs尚不多，植物AFPs的生理生化性質(zhì)、空間構(gòu)型、作用機(jī)制仍不甚清楚，且絕大多數(shù)植物材料中AFPs活性大大低于魚類和昆蟲.因此，如何從植物中分離出更多的、活性更高的AFPs，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行鑒定、比較分析，深入闡明AFPs的抗凍機(jī)制，將是今后植物抗寒性研究的重點(diǎn).據(jù)報(bào)道冬季常綠喬木北海道黃楊能忍耐－23.9℃低溫，若能從中提取抗寒基因并轉(zhuǎn)入其他植物，無(wú)疑將極大提高轉(zhuǎn)基因植株抗寒性.

AFPs是由多基因控制的，而且還與其他環(huán)境因子脅迫發(fā)生交叉作用，使得植物抗寒機(jī)制的研究更具復(fù)雜性.因此，在進(jìn)行植物抗寒性基因工程研究時(shí)，應(yīng)綜合考慮各種環(huán)境脅迫之間的相互作用以及基因的轉(zhuǎn)入對(duì)植物抵抗外界逆境綜合適應(yīng)性的影響，分離純化AFP基因、重要抗凍因子的基因(包括AFPs轉(zhuǎn)錄因子基因及AFPs活化蛋白基因)以及其他多種功能基因，將這些基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步拓寬抗寒基因的來(lái)源，才能為今后植物抗寒性分子改良開辟新的途徑，為培育抗寒新品種奠定基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯:檀彩蓮)

Research Progress in Antifreeze Machanism and Genetic Engineering of Antifreeze Protein

WANG Shao-yun1， LI Xiao-kun1， ZHOU Yan-fu1， WU Jin-hong2
(1.College of Biological Science and Engineering，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350002，China;2.College of Biology and Food Science，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 290002，China)

Antifreeze proteins(AFPs)are the thermal hysteresis proteins that have the ability to modify the growth and inhibit the recrystallization of the ice.Antifreeze proteins aroused great interests of many researchers due to its special structure and functions.Recent studies are focused on their antifreeze mechanism and genetic engineering in attempts to better understand how exactly AFPs work.AFPs have wide applications.They can aid in the food storage and transplant organ cryopreservation，also by transgene they could enhance the antifreeze ability of crops.This article reviewed the recent advance in its antifreeze mechanism and genetic engineering.

antifreeze proteins;mechanism of action;genetic engineering

TS201.2

A

1671-1513(2012)02-0058-06

2011-04-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071498;31000814);留學(xué)回國(guó)人員啟動(dòng)基金項(xiàng)目(819129);福州大學(xué)科技發(fā)展基金項(xiàng)目(2009XQ18).

汪少蕓，女，教授，博士，主要從事食品生物化學(xué)方面的研究.