梁文娜 葉蕻芝廖凌虹 張凌媛 沈建英 陳淑嬌 丁珊珊

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證研究基地，福建 福州 350108)

I型膠原蛋白對骨礦化機(jī)制的影響

梁文娜 葉蕻芝1廖凌虹 張凌媛 沈建英 陳淑嬌 丁珊珊

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證研究基地，福建 福州 350108)

骨質(zhì)疏松;I型膠原蛋白;骨礦化

骨質(zhì)疏松(OP)是以低骨量和骨組織顯微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性骨骼疾病，伴有骨脆性增加，易于發(fā)生骨折。骨強(qiáng)度的問題是引起OP骨折危險性增加重要因素之一，骨強(qiáng)度反映骨骼的兩個主要方面是骨礦密度和骨質(zhì)量。骨的“質(zhì)”和“量”共同決定著骨的強(qiáng)度，恢復(fù)骨質(zhì)量，改善骨生物力學(xué)性能是當(dāng)前研究骨損傷修復(fù)的熱點(diǎn)問題。骨的膠原成分是骨質(zhì)量的重要決定因素之一，本文探討骨基質(zhì)內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)、含量及穩(wěn)定性的異常對骨微結(jié)構(gòu)的退變和生物力學(xué)特性異常的影響，旨在闡述Ⅰ型膠原蛋白與OP的相關(guān)性。

1 Ⅰ型膠原蛋白的生物學(xué)效應(yīng)

骨是一種結(jié)締組織，除有支持和保護(hù)功能外，還有儲存鈣和磷酸鹽的作用。骨具有結(jié)締組織的共同特點(diǎn)，含有基質(zhì)、纖維和細(xì)胞。Ⅰ型膠原蛋白是骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，能夠引導(dǎo)鈣鹽沉積、礦化，并作為沉積的模板，形成羥基磷灰石晶體〔1〕，決定骨的可塑性，也顯著影響骨質(zhì)量。良好的骨生物力學(xué)性能取決于骨骼內(nèi)礦化骨量的多少和骨基質(zhì)所構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)的生物適應(yīng)性，Ⅰ型膠原蛋白非常重要。研究表明Ⅰ型膠原結(jié)構(gòu)、含量及穩(wěn)定性的異常直接關(guān)系到骨微結(jié)構(gòu)的退變和生物力學(xué)特性的異?！?，3〕。Ⅰ型膠原蛋白分子間交聯(lián)的形式構(gòu)建了膠原纖維的有序排列和結(jié)構(gòu)完整，為鈣磷灰鹽結(jié)晶的沉積創(chuàng)造了良好的微環(huán)境，因此骨礦化功能的正常也取決于膠原分子間的良好交聯(lián)形式〔4〕?？傊?，Ⅰ型膠原纖維不僅為骨礦化提供基本結(jié)構(gòu)場所、保證了骨骼的韌性，還在骨細(xì)胞的發(fā)育、分化和活性調(diào)節(jié)等方面起重要作用，膠原結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變可致骨細(xì)胞發(fā)育、分化和功能的異常，進(jìn)而改變骨的結(jié)構(gòu)和性能。

1.1 Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu) 膠原蛋白是一個龐大的家族，種類繁多，結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜，從分子結(jié)構(gòu)、超分子結(jié)構(gòu)，再到組織分布和功能，具有顯著的多樣性。盡管如此，膠原蛋白的基本組成卻是大同小異，在氨基酸序列上都含有(Gly-X-Y)n重復(fù)序列，這些重復(fù)序列是構(gòu)成三聚體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其中X通常為Pro，Y通常為Hy-Pm或Hy-Lys。Ⅰ型原膠原蛋白，即Ⅰ型膠原蛋白的前體，比Ⅰ型膠原蛋白在結(jié)構(gòu)上多2個末端前肽結(jié)構(gòu)(C-前肽與N-前肽)。Ⅰ型原膠原蛋白具有膠原蛋白家族中所有原膠原蛋白的典型特征:首先含有一段具有(Gly-X-Y)n重復(fù)序列的三聚體結(jié)構(gòu)，在N端與C端的2個前肽形成非螺旋的結(jié)構(gòu)域(NC結(jié)構(gòu)域)，位于(Gly-X-Y)n重復(fù)序列兩側(cè)，NC結(jié)構(gòu)域再進(jìn)一步形成球狀結(jié)構(gòu)〔5〕。折疊好的Ⅰ型原膠原蛋白是異源三聚體的結(jié)構(gòu)，即由2條α1鏈與1條α2鏈交互纏繞所形成，膠原三聚體有很高的抗拉強(qiáng)度。Ⅰ型原膠原蛋白分泌到胞外基質(zhì)中后，經(jīng)過蛋白酶的剪切除去C-前肽與N-前肽，就形成了成熟的膠原蛋白。成熟的膠原蛋白能自我組裝成高度有序的結(jié)構(gòu)——膠原纖維〔6〕。

膠原蛋白基因COLIA1與COLIA2是兩條編碼Ⅰ型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的基因，也是重要骨量調(diào)節(jié)基因。COLIA1基因長約18 kb，位于 17q 21.3-q22，COLIA2 基因長 38 kb，位于7q21.3-q22.1，分別由51 個和 52 個外顯子構(gòu)成〔7～9〕。COLI在成骨細(xì)胞生長的整個過程中均起重要的作用，COLI通過其受體整合素α2β1對成骨細(xì)胞發(fā)揮促分化和促細(xì)胞間的黏附作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞發(fā)生分化，增強(qiáng)其成骨能力〔10〕。膠原蛋白基因突變可導(dǎo)致Ⅰ型膠原α1和α2鏈氨基酸排列順序改變，影響Ⅰ型膠原細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外翻譯后修飾活動的改變，從而引起骨基質(zhì)礦化的異常。同時遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原蛋白基因是調(diào)節(jié)骨量的強(qiáng)有力的候選基因，對早期預(yù)測低骨量和骨折危險性具有重要意義〔11〕。由此可見，如何調(diào)控骨內(nèi)Ⅰ型膠原代謝和基質(zhì)礦化的作用機(jī)制，是研究骨重建修復(fù)領(lǐng)域需要迫切解決的關(guān)鍵問題。

1.2 合成Ⅰ型膠原蛋白的調(diào)控機(jī)制 膠原纖維并非在細(xì)胞內(nèi)形成后再分泌出來，而是在細(xì)胞內(nèi)先合成前膠原，再分泌到細(xì)胞外進(jìn)一步轉(zhuǎn)變聚合成膠原纖維。膠原的合成步驟包括基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾(羥基化和糖基化)形成α肽鏈，每個前膠原分子都是由三條α鏈形成三聯(lián)螺旋狀構(gòu)型的纖維狀蛋白質(zhì)，即膠原的基本單位——前膠原，經(jīng)微管排泌到細(xì)胞外切去N端和C端肽后相可交聯(lián)形成膠原纖維或網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。

“羥基化”是膠原蛋白轉(zhuǎn)錄后的修飾特點(diǎn)，通過脯氨酸或賴氨酸羥化酶使脯氨酸或賴氨酸殘基加上羥基。羥脯氨酸羥基通過分子間氫鍵起穩(wěn)定膠原螺旋結(jié)構(gòu)的作用;羥賴氨酸羥基則提供糖類分子的附著位點(diǎn)，并在膠原分泌至胞外后，通過賴氨酸氧化酶在羥賴氨酸、賴氨酸之間醛基縮合，發(fā)揮穩(wěn)定膠原分子間交連的作用。在Ⅰ型膠原蛋白分子的合成涉及一系列復(fù)雜的翻譯后修飾，在賴氨酸羥化酶(LH)作用下的賴氨酸殘基的羥化決定了原膠原分子間的交聯(lián)形式，使得廣泛存在于機(jī)體的Ⅰ型膠原蛋白家族具有不同的組織特異性，如骨膠原主要以羥賴氨酸醛化途徑為主，軟組織的膠原則主要以賴氨酸醛化途徑為主，同時還保證了膠原纖維的有序排列和結(jié)構(gòu)的完整。LH功能的異常或缺陷可導(dǎo)致Ⅰ型膠原分子合成障礙，如過度羥化可導(dǎo)致人和動物的骨基質(zhì)礦化障礙，出現(xiàn)典型的OP或成骨不全。研究表明Ⅰ型膠原的形成與LH密切相關(guān)，在人、大鼠和小鼠體內(nèi)克隆出 LH 的三種異構(gòu)體，即 LH1，LH2 和 LH3〔12，13〕。其中LH1是催化膠原分子螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域醛化的主要酶類，LH2則主要是催化膠原分子端肽部位羥賴氨酸醛化的主要酶類，而端肽區(qū)域的羥賴氨酸醛化是決定膠原分子交聯(lián)形式的關(guān)鍵。研究表明LH2b是LH存在于MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)的主要形式，當(dāng)LH2b過度表達(dá)時，增加雙羥賴己氨酸/羥賴己氨酸的比值和吡啶啉，促進(jìn)交聯(lián)間羥賴氨酸的過度醛化，影響膠原分子交聯(lián)的形式〔14，15〕。綜上所述，LH又是一種可調(diào)節(jié)酶，通過外加干預(yù)因素可調(diào)控LH的生物效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)對Ⅰ型膠原蛋白合成的調(diào)節(jié)。因此，提出以Ⅰ型膠原蛋白為“靶點(diǎn)”，優(yōu)化Ⅰ型膠原蛋白調(diào)控骨代謝的方法來防治OP的新思路。

2 Ⅰ型膠原蛋白影響骨礦化的作用機(jī)制

Ⅰ型膠原蛋白為生物體提供了一種機(jī)械支撐作用，維護(hù)器官與組織的完整性，維持其正常的功能。Ⅰ型膠原蛋白具有形成和保持骨架完整性的作用，在形成特定的細(xì)胞外微環(huán)境中也起到主要作用，而這些微環(huán)境對于維持細(xì)胞的完整性及傳遞細(xì)胞外信號非常關(guān)鍵〔16〕。

Ⅰ型膠原蛋白除有生物力學(xué)作用以外，還有確立細(xì)胞形狀及行為的信號分子、在細(xì)胞分化與發(fā)育中起重要作用。Ⅰ型膠原蛋白分子還可以通過整合素、盤蛋白結(jié)構(gòu)域受體、糖蛋白等跨膜受體向細(xì)胞內(nèi)傳遞不斷變化的外源刺激信號，從而起到信號分子的作用〔17〕，與此同時，膠原蛋白還具有信號“中轉(zhuǎn)站”的功能，能夠截留、貯存、運(yùn)輸生長因子，從而在器官發(fā)育、傷口愈合和組織修復(fù)等過程中充當(dāng)重要角色。骨質(zhì)疏松性骨折是骨結(jié)構(gòu)的退變所造成的病理改變，可能是由于Ⅰ型膠原蛋白基因表達(dá)異常，膠原蛋白分子間交聯(lián)形式、排列改變所造成成骨異常。成骨作用包含膠原的合成和骨基質(zhì)的礦化，骨基質(zhì)的礦化主要由局部的生長因子來調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)是耦合骨吸收與骨形成的調(diào)節(jié)劑，可抑制新破骨細(xì)胞的形成，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞程序性死亡，可增加成骨細(xì)胞的增殖及Ⅰ型膠原蛋白的合成，同時可刺激幾種骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生，如纖維結(jié)合蛋白、蛋白聚糖和骨黏連素等，從而促進(jìn)骨基質(zhì)礦化的作用〔18，19〕。

TGF-β是一族多功能細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，在骨基質(zhì)內(nèi)含量最豐富的生長因子，是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間相互耦聯(lián)的調(diào)節(jié)因子之一。人類TGF-β基因位于染色體19q13，由7個外顯子組成，富含GC和Ap2序列，基因水平的調(diào)節(jié)是通過Ap2啟動子的激活來實(shí)現(xiàn)的。TGF-β發(fā)揮生物學(xué)作用的途徑是 TGF-β-Smad信號途徑〔20～22〕，其能影響成骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)，最終影響Ⅰ型膠原蛋白的礦化。研究表明TGF-β能增強(qiáng)Ⅰ型原膠原蛋白的生物合成，在組織修復(fù)的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Ⅰ型膠原蛋白能結(jié)合核心蛋白聚糖，間接阻斷TGF-β可能是正常組織的一種反饋調(diào)節(jié)作用。因此，可以利用現(xiàn)代基因分子生物學(xué)技術(shù)，有效地調(diào)控由局部的生長因子的生物學(xué)效應(yīng)，干預(yù)Ⅰ型膠原蛋白的礦化過程，從而有效的提高骨質(zhì)量，改善骨的生物力學(xué)性能。

3 Ⅰ型膠原蛋白的研究前景

OP是一種多因素疾病，人體骨量既受遺傳因素影響，同時還受到體內(nèi)激素水平、鈣攝入量、體力活動水平等環(huán)境因素的影響。隨著世界人口老齡化，OP已成為一個世界性的公共健康問題，由OP導(dǎo)致的骨痛和病理性骨折嚴(yán)重影響著老齡人群的生活質(zhì)量。因此，提高骨質(zhì)量了來改善骨骼的力學(xué)強(qiáng)度、減少骨折的發(fā)生，延緩OP的進(jìn)展是目前研究的熱點(diǎn)之一。骨骼的強(qiáng)度不等同于骨量，強(qiáng)度是從整體上評估力學(xué)性能，除骨量外骨骼的強(qiáng)度還受到骨小梁的空間結(jié)構(gòu)、骨礦鹽的分布等微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的因素影響。骨的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)主要是由Ⅰ型膠原蛋白分子間的良好交聯(lián)形式?jīng)Q定，因此如何有效調(diào)控Ⅰ型膠原代謝與骨基質(zhì)的礦化，提高骨質(zhì)量和糾正失衡的骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，在一定程度上可以延緩和修復(fù)骨結(jié)構(gòu)的破壞，將為OP的防治開辟一個新的視角。

1 Liebscher MA.Biomimetic considerations of animal models used in tissue engineering of bone〔J〕.Biomaterials，2004;25(9):1697-714.

2 Kurihara H，Shinohara H，Yoshino H，et al.Neurotrophins in cultured cells from periodontal tissues〔J〕.Periodontol，2003;74(1):76-84.

3 衛(wèi)愛林，葉小豐，劉世清，等.磷酸三鈣/透明質(zhì)酸/Ⅰ型膠原/骨髓基質(zhì)胞復(fù)合物修復(fù)骨缺損與自體骨的比較〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007;11(9):1779-882.

4 井 玲，齊 玲，徐 輝，等.氟對成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)和成骨結(jié)節(jié)形成的影響〔J〕.中國地方病學(xué)雜志，2007;26(4):387-9.

5 Ishibashi O，Inui T，Mori Y，et al.Quantification of the expression levels of lysosomal eysteine proteinases in purified human osteoclastie cells by competitive RT-PCR〔J〕.Calcif Tissue Int，2001;68(2):109-16.

6 Blades HZ，Arundel P，Carlino WA，et al.Collagen gene polgmorphisms in fluence fracture risk and bone neass acqnisition during childhood and adolescent growth〔J〕.Bone，2010;47(5):989-94.

7 Suuriniemi M，Mahonen A，Kovanen V，et al.Relation of PvuⅡ site polymorphism in the COL1A2 gene to the risk of fractures in prepubertal finnish girls〔J〕.Physiol Genomics，2003;14(7):217-24.

8 Lau EM，Choy DT，Li M，et al.The relationship between COLIA1 polymorphisms(Sp 1)and COLI A2 polymorphisms(EcoR1 and PuvⅡ)with bone mineral density in Chinese men and women〔J〕.Calcif Tissue Int，2004;75(4):133-7.

9 Lei SF，Deng FY，Xiao SM，et al.Association and haplotype analyses of the COL1A2 and ER-αgene polymorphisms with bone size and height in Chinese〔J〕.Bone，2005;36(3):533-41.

10 雷 濤，張立娟，張秀珍.淫羊藿甙對成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原和整合素α2β1表達(dá)的影響〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2007;23(3):226-7.

11 何進(jìn)衛(wèi)，章振林.上海絕經(jīng)后婦女Ⅰ型膠原α1基因多態(tài)性與骨密度關(guān)系的研究〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2007;10(7):531-2.

12 羅忠金，譚 彬，黃年根，等.反義寡脫氧核苷酸抑制賴氨酸羥化酶2mRNA表達(dá)及膠原形成〔J〕.中華消化雜志，2005;25(11):691-2.

13 Zissimopoulos A，Petrakis G，Stellos K，et al.Procollagen-I，collagen telopeptide I，CEA，CA 15-3 as compared to bone scintigraphy in patients with breast cancer〔J〕.Hell J Nucl Med，2006;9(1):60-4.

14 Pornprasetsuk S，Duarte WR，Mochida Y，et al.Overexpression of lysyl hydroxylase-2b leads to defective collage fibrillogenesis and matrix mineralization〔J〕.J Bone Miner Res，2005;20(1):81-92.

15 Mercer DK，Nicol PF，Kimbembe C，et al.Identification，expression，and tissue distribution of the three rat lysyl hydroxylase isoforms〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;30(8):803-9.

16 Gelse K，Poschl E，Aigner T.Collagen-structure function and biosynthesis〔J〕.Adv Drug Delivery Rev，2003;55(12):1531-6.

17 隋國良，彭依群，翟木緒.RNA干擾沉默CTGF表達(dá)對人成骨樣MG63細(xì)胞Ⅰ型膠原、ALP mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志，2007;13(7):469-73.

18 Verrecchia F，Mauviel A.TGF-β and TNF-α:antagonistic cytokines controlling typel collagen gene expression〔J〕.J Cell Sig，2004;16(8):873-80.

19 Hui AY，Dannenberg AJ，Sung JJ，et al.Prostaglandin E2 inhibits transforming growth factor beta 1-mediated induction of collagen alpha 1(I)in hepatic stellate cells〔J〕.J Hepatol，2004;41(2):251-8.

20 Alliston T，Choy L，Ducy L，et al.TGF-β induced repression of CBFAl by Smad3 decreases Cbfal and ostemalcin expression and inhibits osteoblast differentiation〔J〕.EMBO J，2001;20(9):2254-72.

21 Ueda H，Nakamura T，Yamamoto M，et al.Repairing of rabbit skull defect by dehydrothermly Crosslinked collagen sponges in corporating transforming growth factor betal 1〔J〕.J Controlled Release，2003;88(1):55-64.

22 Sun JS，F(xiàn)eng H，Wang YJ，et al.Collagen-hydroxyapatite/tricalcium phosphere microspheres as a delivery system for Rh TGF-β1〔J〕.Aritif Organs，2003;27(7):605-12.

〔2011-01-24收稿 2011-04-10修回〕

(編輯 曹夢園)

R681

A

1005-9202(2012)17-3840-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.126

福建省自然科學(xué)基金(No.2009J01172)

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院

葉蕻芝(1968-)，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥防治骨性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

梁文娜(1979-)，女，講師，博士，主要從事內(nèi)分泌病證研究。