郝 飛，湯德元*，羅險(xiǎn)峰，李春燕，曾智勇，甘振磊，王 鳳, 劉 建

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550008)）

豬博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV )是一種新型的細(xì)小病毒，屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科博卡病毒屬。豬感染該病毒后主要癥狀為腹瀉，并集中在產(chǎn)房哺乳仔豬，哺乳仔豬死亡率達(dá)70%以上，抗生素治療和腹瀉性疫苗免疫均不能獲得效果。目前博卡病毒屬成員有牛細(xì)小病毒、人博卡病毒（1～4型）、犬微小病毒、豬博卡病毒、大猩猩博卡病毒以及黑猩猩博卡病毒。2009年瑞典科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)第1例豬博卡病毒（PBo-Like virus），此后在中國(guó)境內(nèi)上海市、浙江省、湖北省、江蘇省以及貴州省等地相繼發(fā)現(xiàn)并分離到豬博卡病毒。

1 病毒的發(fā)現(xiàn)

2009年，瑞典研究人員Blomstr?m等采集病死豬的淋巴結(jié)進(jìn)行研磨，經(jīng)一系列處理后提取DNA，采用隨機(jī)多重置換擴(kuò)增法（MDA）和高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，最終將獲得的所有片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，拼接出一條1879 bp的新型細(xì)小病毒片段，經(jīng)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的片段與人博卡病毒較為相似，且其主要是NP蛋白和部分VP1蛋白的編碼序列，故暫將其命名為豬類博卡病毒（PBo-Like Virus, PBoLV）[1]。隨后翟少倫等[2]參照Blomstr?m等人獲得的豬類博卡病毒的序列設(shè)計(jì)引物，于2010年首次在中國(guó)檢測(cè)出了豬博卡病毒。研究表明[3]，豬博卡病毒流行確實(shí)存在，并且全基因組相近于博卡病毒屬，故將其劃為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬。

2 病毒的分子特征

PBoV是一種單鏈無(wú)包膜的DNA病毒，體積小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，為正20面體顆粒，直徑約為25～30 nm?；蚪M為單鏈線性DNA，大小約為4786～5905 bp。各類型豬博卡病毒的基因組結(jié)構(gòu)基本一致，基因組編碼3個(gè)開放閱讀框（ORF），ORF1（5’末端）編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，有4個(gè)亞基因組，并存在著與病毒滾環(huán)復(fù)制、解螺旋酶以及三磷酸腺苷酶活性相關(guān)的保守序列；ORF2（3’端）編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2，有2個(gè)亞基因組，VP1編碼的序列內(nèi)存在與病毒感染性相關(guān)的磷脂酸A2序列（與Ca2+結(jié)合環(huán)及催化殘基相關(guān)序列相連）[4]；ORF3（中間序列）編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP，其主要功能還不明確。VP1/VP2是PBoV的主要抗原基因。但Cheung等[5]研究發(fā)現(xiàn)PPV4的序列為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度約5905 bp。

當(dāng)前國(guó)際上對(duì)豬博卡病毒尚無(wú)統(tǒng)一的分類，筆者參考GenBank上登錄的豬博卡病毒全序列暫將其為以下幾個(gè)基因型：豬類博卡病毒（PBo-Like Virus, PBoLV）基因組大小4786 bp（GenBank Number:HQ223038）；豬博卡病毒1型（(Porcine Bocavirus Type 1, PBoV1）基因組大小5267 bp（GenBank Number:HQ291308）；豬博卡病毒2型（(Porcine Bocavirus Type 2, PBoV2）基因組大小5186 bp（GenBank Number:HM053694）；豬博卡病毒3型（(Porcine Bocavirus Type 3, PBoV3）基因組大小4710 bp（GenBank Number:JF713714）；豬博卡病毒4型（(Porcine Bocavirus Type 4, PBoV4）基因組大小4125 bp（GenBank Number:JF512473）；豬博卡病毒5型（(Porcine Bocavirus Type 5, PBoV5）基因組大小5076 bp（GenBank Number:JN831651）；豬細(xì)小病毒4型（Porcine Parvovirus Type4, PPV4）基因組大小5400 bp（GenBank Number:HEN0922-5400）。

3 流行病學(xué)

豬是已知豬博卡病毒唯一的易感動(dòng)物。病豬和帶毒豬是其主要傳染源，不同年齡、性別的家豬和野豬均可感染。自2009年首例PBoV在瑞典被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前PBoV還只在瑞典、北愛(ài)爾蘭、美國(guó)和中國(guó)的家豬被檢測(cè)并分離。此外，在羅馬尼亞和烏干達(dá)的野豬體內(nèi)也檢測(cè)到了該病毒[6-7]。2009年翟少倫等檢測(cè)了來(lái)自浙江、江西、安徽、河北、河南、江蘇、北京、上海、新疆9省市自治區(qū)的送檢病料，PBoV的檢出率在12.5%～ 88.9%之間，并且在健康的豬樣品中也檢測(cè)到PBoV的存在，檢出率為7.3%（3/41）。2010年Shan等[8]在來(lái)自上海、江蘇、安徽、山東以及貴州的共計(jì)340份健康豬病料中檢測(cè)到PBoV，其陽(yáng)性率為45%～75%。表明貴州省存在豬博卡病毒的流行。2010年Cheng等共檢測(cè)了397份臨床病料，檢出PBoV的陽(yáng)性率為12.59%。黃律等[9]檢測(cè)了2006－2010年間來(lái)自安徽、福建、廣西、河南、河北、湖北、江蘇、江西、山東、上海、浙江以及新疆的705份樣品（包括發(fā)病豬樣品573份，健康豬樣品132份），發(fā)病豬樣品中PPV4檢出率（2.09%，12/573）顯著高于健康豬樣品（0.76%，1/132）。這些研究表明目前我國(guó)豬博卡病毒的檢出率非常高。

4 臨床癥狀

豬博卡病毒可引起豬呼吸道與腸道感染，使之出現(xiàn)支氣管炎、肺炎以及急性或慢性胃腸炎癥狀，引發(fā)流產(chǎn)、死胎，甚至死亡。哺乳仔豬多在出生 2～3 d后出現(xiàn)劇烈的腹瀉，排淡綠色、黃綠色或灰白色水樣糞便，部分仔豬有嘔吐癥狀，病豬迅速脫水消瘦，精神沉郁、被毛粗亂，少食或不食，多數(shù)于 5～7 d內(nèi)死亡，10 日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá) 50%～80%，隨日齡的增加死亡率降低。病死豬消瘦、脫水、胃黏膜充血，有時(shí)有出血點(diǎn)，小腸黏膜充血腸壁變薄無(wú)彈性，內(nèi)含水樣稀便，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。此外，豬博卡病毒對(duì)發(fā)生豬圓環(huán)病毒病與腹瀉性疫病的豬只具有促進(jìn)與加重病情的作用[10]。

5 診斷方法

5.1 間接免疫熒光技術(shù)（IFA）

首先將待檢細(xì)胞用未標(biāo)記的抗體處理，使之與特異的抗原形成復(fù)合物，然后再用抗抗體的熒光標(biāo)記抗體著色，可檢測(cè)出特異抗原在細(xì)胞中的存在部位，并具有熒光增強(qiáng)效應(yīng)。McKillen等[11]在建立PBoV原代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，為了鑒定豬博卡病毒在細(xì)胞上的生長(zhǎng)情況，構(gòu)建了間接免疫熒光方法，并在豬原代腎細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)現(xiàn)了綠色熒光集結(jié)。

5.2 血清學(xué)診斷方法

李彬等[12]對(duì)PBoV1的NP1基因進(jìn)行克隆與表達(dá)載體構(gòu)建，通過(guò)表達(dá)后，其表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量為46 ku，通過(guò)Western Blot，結(jié)果顯示表達(dá)的NP1蛋白能與His抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，表明原核表達(dá)的NP1蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為診斷抗原的候選蛋白。為豬博卡病毒的血清學(xué)診斷方法奠定了理論基礎(chǔ)。黃律[13]首次對(duì)PPV4的各個(gè)ORF框進(jìn)行真核表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)只有PPV4的NS所表達(dá)的蛋白能夠和PPV4陽(yáng)性血清反應(yīng)，對(duì)NS蛋白進(jìn)行原核表達(dá)得到的蛋白要遠(yuǎn)小于NS實(shí)際編碼蛋白的大小，僅約26 ku。最終純化獲得的PPV4 NS蛋白可用于監(jiān)測(cè)臨床血清中的抗體水平。

5.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)[14]因其較好的敏感性、特異性和重復(fù)性，常被用來(lái)診斷病毒的DNA。博卡病毒的型內(nèi)基因組序列相對(duì)保守，非常便于PCR引物設(shè)計(jì)，PBoV目前主要采用NP、NS1片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。翟少倫等[15]首次建立了PBoV的PCR診斷方法，該法特異性強(qiáng)，敏感度高且重復(fù)性好。在對(duì)191份臨床樣品檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性率達(dá)39.3%（75/191），敏感性達(dá)32.2 ng/μL。該P(yáng)CR方法的建立為豬博卡病毒分子流行病學(xué)的研究提供了快捷有效的檢測(cè)方法（普通PCR儀即可操作）。此外，還可有效防止PBoV在我國(guó)的全面流行，尤其是在跨區(qū)引種時(shí)具有重要的作用。胡軍勇等[16]建立的PCR診斷方法，具有良好的穩(wěn)定性、特異性、敏感性，在對(duì)248份病料樣品檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性率達(dá)69.35%（172/248）。該方法對(duì)PBoV的最低檢測(cè)量為213.6拷貝，為臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的支持。

5.4 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）省去了普通PCR的凝膠成像步驟，大大縮短了病毒的檢測(cè)時(shí)間。Li等[17]建立了PBoV1的RT-PCR診斷方法，在對(duì)258份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性率達(dá)44.2%（114/258），敏感性達(dá)20個(gè)質(zhì)?？截?，特異性與重復(fù)性均較好。黃律等[18]建立了PPV4的Taq Man熒光定量PCR診斷方法，該法快速敏感且特異性高，在6.73×109copies/μL～6.73×101copies/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998；對(duì)PPV4的最低檢測(cè)限為6.73×101copies/μL。該方法的建立不僅可用于臨床病料的檢測(cè)，還為PBoV的體外敏感細(xì)胞的篩選以及病毒器官嗜性的研究提供了快捷敏感的分子檢測(cè)技術(shù)，大大促進(jìn)了PBoV分子流行病學(xué)的發(fā)展，為今后PBoV的深入研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

5.5 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一條具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、高特異性地?cái)U(kuò)增靶序列。近年來(lái)該法被廣泛應(yīng)用于病原體的檢測(cè)。江蘇省農(nóng)科院的李彬等發(fā)明了豬博卡病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，最低可檢測(cè)到10個(gè)拷貝。其LAMP檢測(cè)試劑盒不需要先進(jìn)的儀器，避免了現(xiàn)有豬博卡病毒檢測(cè)手段存在的問(wèn)題，并且具有特異性強(qiáng)、敏感度高、檢測(cè)周期短、操作簡(jiǎn)便以及易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。該方法的有效建立，豐富了豬博卡病毒的分子流行病學(xué)研究的方法，且大大縮短了豬博卡病毒的檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)一步減少了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染機(jī)會(huì)（只需一步即可完成實(shí)驗(yàn)），為大規(guī)模的豬博卡病毒檢測(cè)調(diào)查提供了有效的方法。

6 防治方法

6.1 對(duì)癥治療

豬博卡病毒可導(dǎo)致哺乳仔豬嚴(yán)重腹瀉甚至脫水死亡，對(duì)于發(fā)病豬需進(jìn)行補(bǔ)液治療，方法如下：口服法，按飲水加成品的口服補(bǔ)液鹽 30 g/kg 和適當(dāng)抗生素（如慶大霉素等）灌服（2次/d）；腹腔注射法，根據(jù)豬只大小采用 5%葡萄糖生理鹽水 200 ～300 mL、5% 碳酸氫鈉注射液 30 ～50 mL，腹腔注射（1 次/d）連續(xù)注射 2 ～4 d。相關(guān)研究表明，以雞新城疫Ⅰ系疫苗為干擾源注射，可明顯減輕相關(guān)病毒性腹瀉癥狀。1 瓶雞新城疫疫苗( 按 500 羽/份計(jì)) 可注射 15 日齡以內(nèi)的仔豬 10 頭，可注射 15 日齡以上仔豬（10 kg左右） 5 頭。此外，發(fā)病豬場(chǎng)在仔豬出生 1 ～2 d 內(nèi)，分別肌注長(zhǎng)效頭孢噻夫晶體注射液 0.2 mL/頭，肌注右旋糖苷鐵 1 ～ 2 mL/頭，可增強(qiáng)仔豬抵抗力，明顯降低豬只死亡率。

6.2 母豬返飼

目前市場(chǎng)上尚無(wú)商品化的豬博卡病毒疫苗，規(guī)?；i場(chǎng)及散養(yǎng)戶需做好豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、豬喘氣病、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性胃腸炎及流行性腹瀉等其他疫病的綜合防治。因此，需提前對(duì)母豬進(jìn)行返飼以預(yù)防該類疫病，該法效果良好，但應(yīng)盡量提早。所謂返飼，即采集仔豬糞便或病豬的腸內(nèi)容物，研磨后加水浸泡 30 min，加入適量抗生素類藥物（如阿莫西林），經(jīng)多次過(guò)濾后與飼料攪拌均勻，對(duì)產(chǎn)前 6 周以內(nèi)的母豬進(jìn)行飼喂，每天1次，連續(xù)飼喂3 ～ 4 d，間隔 3 周后再重復(fù)飼喂一個(gè)階段。采集腹瀉糞便時(shí)需要注意保持新鮮無(wú)腐敗無(wú)污染，返飼母豬飼料中需適當(dāng)加入藥物進(jìn)行保健。

6.3 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

精心引種，注意不從疫區(qū)引種，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，最好建立無(wú)特定病原體豬群，以免病原體傳入和擴(kuò)散，同時(shí)還得實(shí)行早期隔離斷奶。對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行隔離治療，最好淘汰，對(duì)病死豬進(jìn)行科學(xué)處理，搞好畜舍衛(wèi)生，定期消毒。因博卡病毒對(duì)碘制劑較為敏感，豬場(chǎng)可使用碘制劑類等加強(qiáng)消毒，并在欄舍和潮濕處撒生石灰，進(jìn)行干燥消毒。同時(shí)還要注意母豬防暑降溫、仔豬保溫、畜舍通風(fēng)干燥。

綜上所述，豬博卡病毒作為一種新型的病毒，其許多特性都不同于傳統(tǒng)的細(xì)小病毒科病毒，目前人們對(duì)該病毒的研究還只停留在初級(jí)階段。對(duì)豬博卡病毒的防控不僅僅是要控制它的發(fā)生，還必須與遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和氣候以及飼養(yǎng)管理等學(xué)科相配合，從不同角度開展研究，進(jìn)而控制豬博卡病毒的發(fā)生和發(fā)展，確保規(guī)模化豬場(chǎng)的生產(chǎn)安全。

[1] BLOMST?M A L, BEL!K S,FOSSUM C, et al. Detection of a novel porcine boca-like virus in background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J]. Virus Res,2009, 146(1-2):125-129.

[2] ZHAI S, YUE C, WEI Z, et al. High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China[J]. Arch Virol,2010,155(8):1313-1317.

[3] ZENG S, WANG D, FANG L, et al. Complete coding sequences and phylogenetic analysis of porcine bocavirus[J]. J Gen Virol, 2011,92:784-788.

[4] LAU S K, WOO P C, YIP C C, et al. Co-existence of multiple strains of two novel porcine bocaviruses in the same pig, a previously undescribed phenomenon in members of the family Parvoviridae, and evidence for inter-and intra-host genetic diversity and recombination[J]. J Gen Virol,2011,92(Pt9):2047-2059.

[5] CHEUNG A K, WU G, WANG D, et al. Identification and molecula cloning of a novel porcine parvovirus[J]. Arch Virol, 2010,155(5):801!806.

[6] CADAR D, CS!GOLA A,L!RINCZ M, TOMB!CZ K, KISS T,SP!NU M, TUBOLY T (2011).Genetic detection and analysis of porcine bocavirus type 1(PoBoV1) in European wild boar(Sus scrofa)[J].Virus Genes, 43:376-379.

[7] BRINK M. Porcine viruses in Uganda -a study of TTSuV and PPV4 in wild and domestic pigs[D].Uppsala：Swedish University of Agricultural Sciences, 2011.

[8] SHAN T, LAN D, LI L, et al.Genomic characterization and high prevalence of bocaviruses in swine[J/OL]. PLoS One,2011,6(4):e17292.

[9] Huang L, Zhai S L, Cheung A K,et al. Detection of a novel porcine parvovirus, PPV4, in Chinese swine herds[J]. Virol J,2010,7:333.

[10] 馬怡雋，范紅結(jié)．豬博卡病毒的研究進(jìn)展[J]．青海畜牧獸醫(yī)雜志，2012，42（3）：39-41．

[11] McKillen J, McNeilly F, Duffy C,et al. Isolation in cell cultures and initial characterization of two novel bocavirus species from swine in Northern Ireland[J]. Vet Microbiol,2011,152(1):39-45.

[12] 李彬，毛立，何孔旺，等．豬博卡病毒NP1基因的克隆與原核表達(dá)[J]．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（3）：28-31．

[13] 黃律．豬細(xì)小病毒四型的初步研究[D]．上海：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，2011．

[14] Eehevetria M G, Peeoraro M R,Pereyra N B, et al. Rapid diagnosis of Pseudorabies virus infection in swine tissues using the Polymerase chain reaetion (PCR)[J]. Rev Argent Mierobiol, 2000, 32(3):109-115.

[15] 翟少倫，岳城，韋祖樟，等．豬博卡病毒PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J]．中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18（2）：14-17．

[16] 胡軍勇，張倩，王丹丹，等．豬博卡病毒PCR檢測(cè)方法的建立及其初步流行病學(xué)調(diào)查[J]．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012,34（8）： 632-636．

[17] LI B, XIAO S, MA J, et al.Development of a novel TaqManbased real-time PCR assay for the detection of porcine bocalike virus(Pbo-likeV)[J]. Virol J,2011,8:357.

[18] 黃律，龍進(jìn)學(xué)，翟少倫，等．豬細(xì)小病毒4型Taq Man熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011,32（1）：1-9．