楊麗娟 顧地周 王秋爽 禚玲玲 潘 雨 付 航 張學(xué)士

(通化師范學(xué)院，通化，134002)

鹿角杜鵑(Rhododendron latoucheae Franch.)又稱巖杜鵑，是杜鵑花科杜鵑花屬的常綠灌木或小喬木。主要分布浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川和貴州等地的山坡灌叢或雜木林中。鹿角杜鵑是優(yōu)良的、有待研究開發(fā)的園林綠化樹種，可引種馴化成為露地栽培的園藝觀賞植物，是杜鵑育種的重要種質(zhì)資源。利用種子和嫁接等方法繁殖存在種子萌發(fā)率和繁殖系數(shù)極低等問題，使其開發(fā)及利用受到極大限制。向光鋒等［1］利用1年生完全木質(zhì)化的鹿角杜鵑枝條進(jìn)行了扦插研究，平均成活率達(dá)85%，扦插生根速度較慢。江蘇省農(nóng)科院劉曉青等人以鹿角杜鵑嫩莖尖或莖段為材料，通過基部愈傷組織再分化形成叢生芽的方式對鹿角杜鵑進(jìn)行離體培養(yǎng)，生根率為85.4%，但并未建立高效的快繁體系。本研究利用植物組織培養(yǎng)方法，以鹿角杜鵑嫩葉為材料，通過誘導(dǎo)嫩葉產(chǎn)生愈傷組織、愈傷組織再分化形成叢生芽方式對鹿角杜鵑進(jìn)行快繁，為避免愈傷組織叢生芽苗遺傳多樣性在繼代過程中的可能丟失，又在生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上探索節(jié)增殖的高效植株再生體系，以開創(chuàng)一步成苗技術(shù)，提高增殖系數(shù)。目前，與其同屬的其他種植物離體培養(yǎng)和鹿角杜鵑其他方面研究已有報(bào)道［2-6］，但利用鹿角杜鵑葉片離體培養(yǎng)和節(jié)增殖建立高效植株再生體系研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的來源和處理

鹿角杜鵑枝條采自江西省井岡山，將枝條莖尖剪除后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)水培促其腋芽萌發(fā)生長。待腋芽萌發(fā)放出鮮嫩葉片后將嫩葉剪下，用70%酒精涮洗5 s，再用3%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗6次，無菌濾紙吸干表面水分后備用。

1.2 鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)

以DR為基本培養(yǎng)基［7］，附加不同質(zhì)量濃度的玉米素ZT(由預(yù)試驗(yàn)確定為2.10～2.80 mg·L-1)和吲哚乙酸IAA(由預(yù)試驗(yàn)確定為0.30～0.70 mg·L-1)，內(nèi)含蔗糖 30 g·L-1，瓊脂粉 7.0 g·L-1，調(diào)節(jié)pH值為5.7，將1.1中處理的葉片切割成0.50 cm左右的葉碟接種到培養(yǎng)基中，在溫度(26±2)℃、光照強(qiáng)度800 lx、光照周期12 h·d-1條件下培養(yǎng)。為了提高鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)的速度和誘導(dǎo)率，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，選用U10(102)均勻表，每個(gè)處理接種10個(gè)葉碟數(shù)，重復(fù)3次取誘導(dǎo)率的平均值，篩選誘導(dǎo)鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織的玉米素和吲哚乙酸最適宜的質(zhì)量濃度配比。嫩葉碟培養(yǎng)40 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.3 鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織的芽苗再分化

以DR為培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的玉米素ZT(由預(yù)試驗(yàn)確定為2.60～3.30 mg·L-1)、吲哚乙酸 IAA(由預(yù)試驗(yàn)確定為0.05～0.20 mg·L-1)和激動(dòng)素 KT(由預(yù)試驗(yàn)確定為 1.30～1.80 mg·L-1)，加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.0 g·L-1，調(diào)節(jié) pH 值為5.7，將嫩葉愈傷組織切割成小塊，在溫度(28±2)℃、光照強(qiáng)度1 200 lx、光照周期10 h·d-1條件下培養(yǎng)。選用U12(123)均勻表，每個(gè)處理接種愈傷組織塊數(shù)為10，重復(fù)3次，篩選最適合鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織芽苗分化的玉米素、吲哚乙酸和激動(dòng)素質(zhì)量濃度配比。愈傷組織培養(yǎng)45 d統(tǒng)計(jì)分化率。

1.4 鹿角杜鵑芽苗生根、植株高效再生體系和煉苗

以1/4DR為培養(yǎng)基，并附加不同質(zhì)量濃度的激動(dòng)素 KT(由預(yù)試驗(yàn)確定為0.20～0.75 mg·L-1)、吲哚乙酸IAA(由預(yù)試驗(yàn)確定為0.10～0.20 mg·L-1)和吲哚丁酸IBA(由預(yù)試驗(yàn)確定為0.05～0.15 mg·L-1)，添加蔗糖 10 g·L-1，瓊脂 6.8 g·L-1，調(diào)節(jié) pH為5.6，待愈傷組織再分化的芽苗長至2.00 cm時(shí)，將切下芽苗接種到培養(yǎng)基中，在溫度(23±2)℃、光照強(qiáng)度800 lx、光照周期8 h·d-1條件下培養(yǎng)。為了提高鹿角杜鵑的生根率，選用U12(123)均勻表，每個(gè)處理接種芽苗數(shù)為10，重復(fù)3次取平均值，篩選最適合鹿角杜鵑再生芽苗生根的激動(dòng)素、吲哚乙酸和吲哚丁酸的質(zhì)量濃度配比。芽苗培養(yǎng)40 d統(tǒng)計(jì)生根率。

采取節(jié)增殖方式對鹿角杜鵑進(jìn)行高效快繁，待生根的苗伸長至3.00 cm以上時(shí)，在超凈工作臺(tái)上打開培養(yǎng)瓶，將生根的苗留1或2葉剪下苗干，并切割成1或2葉1段轉(zhuǎn)接到附加赤霉素GA32.30 mg·L-1的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行腋芽萌發(fā)伸長同時(shí)生根培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算每瓶中每段莖節(jié)的增殖倍數(shù)和周期。

芽苗生根后，從培養(yǎng)瓶中取出再生植株，在含有10 mg·L-1高錳酸鉀溶液中洗去根部殘留的瓊脂，然后植入經(jīng)200倍液的殺毒礬消毒過的V(草炭土)∶V(河砂)∶V(腐爛松針)=3∶1∶2的混合基質(zhì)中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，相對濕度保持在80%，溫度控制在(20±2)℃，每天自然光照12 h，每天中午適當(dāng)通風(fēng)換氣，每天早晚噴灑清水各1次。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

通過均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后摸索出各因素對愈傷組織誘導(dǎo)率、芽苗分化率和生根率的影響，再經(jīng)過進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)篩選愈傷組織誘導(dǎo)、芽苗再分化和生根的主要因素質(zhì)量濃度。均勻設(shè)計(jì)軟件采用Uniform Design 3.0V。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中影響鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)的主要因素篩選

表1中試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后可知，檢驗(yàn)值 Ft＞臨界值 F(0.05，2，7)，說明回歸方程顯著(表2)。通過回歸方程可知，玉米素和吲哚乙酸的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為2.80和0.70 mg·L-1，以此組合計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率的最優(yōu)解為97.5%，此解為回歸方程的解析解，需按公式Y(jié)=y±uα·s(其中uα為正態(tài)分布的雙側(cè)分位數(shù)，s為剩余標(biāo)準(zhǔn)差)計(jì)算出優(yōu)化值估計(jì)區(qū)間為93.86%～101.14%。由回歸方程可知，玉米素和吲哚乙酸均與愈傷組織誘導(dǎo)率呈正相關(guān)，以免玉米素在2.10 mg·L-1和吲哚乙酸在0.70 mg·L-1以上有更高的愈傷組織誘導(dǎo)率，因此，又以玉米素質(zhì)量濃度為 2.10～2.50 mg·L-1，以及吲哚乙酸質(zhì)量濃度為0.70～1.00 mg·L-1做了9個(gè)處理補(bǔ)充試驗(yàn)(重復(fù)3次取平均值)，結(jié)果表明：玉米素質(zhì)量濃度為2.60 mg·L-1和吲哚乙酸為0.75 mg·L-1時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高且愈傷組織質(zhì)量和形態(tài)最好。按1.2中的的方法，將葉片切割成0.50 cm左右的葉碟接種到附加玉米素2.60 mg·L-1和吲哚乙酸0.75 mg·L-1的DR培養(yǎng)基上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(重復(fù)3次取平均值)。葉碟培養(yǎng)6 d開始增厚;繼續(xù)培養(yǎng)至20 d，葉碟逐漸增厚變形，在葉塊表面出現(xiàn)綠色的愈傷組織;培養(yǎng)至40 d，葉碟完全轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色的愈傷組織(圖1a)，誘導(dǎo)率達(dá)99.2%，比表1中10個(gè)處理的誘導(dǎo)率均高，且在估計(jì)區(qū)間內(nèi)。

2.2 培養(yǎng)基中影響鹿角杜鵑愈傷組織芽苗再分化的主要因素篩選

表3中試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后可知，檢驗(yàn)值 Ft＞臨界值 F(0.05，3，8)，回歸方程顯著(表2)。由回歸方程和回歸分析結(jié)果可知，玉米素、吲哚乙酸和激動(dòng)素的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別是3.30、0.05 和 1.80 mg·L-1，那么，最優(yōu)解析解為97.0%，優(yōu)化值估計(jì)區(qū)間為93.59%～100.41%。由表2可知，玉米素和激動(dòng)素均與分化率呈正相關(guān)，吲哚乙酸與分化率呈負(fù)相關(guān)。避免玉米素質(zhì)量濃度在3.30 mg·L-1和激動(dòng)素在1.80 mg·L-1以上及吲哚乙酸在0.05 mg·L-1以下有較高的分化率，因此，以玉米素質(zhì)量濃度為3.30～3.50 mg·L-1，吲哚乙酸質(zhì)量濃度為 0～0.05 mg·L-1，以及 KT 質(zhì)量濃度為 1.80～2.00 mg·L-1做了12個(gè)處理的補(bǔ)充試驗(yàn)，重復(fù)3次取平均值，發(fā)現(xiàn)玉米素質(zhì)量濃度為3.35 mg·L-1，吲哚乙酸質(zhì)量濃度為 0.05 mg·L-1，激動(dòng)素質(zhì)量濃度為 1.90 mg·L-1時(shí)愈傷組織分化率最高且芽苗形態(tài)最佳。待嫩葉碟完全脫分化形成愈傷組織后，將愈傷組織切割成小塊將其接種到添加玉米素3.35 mg·L-1、吲哚乙酸0.05 mg·L-1和激動(dòng)素 1.90 mg·L-1的 DR 培養(yǎng)基上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，培養(yǎng)12 d發(fā)現(xiàn)愈傷組織表面產(chǎn)生大量顆粒狀小凸起，繼續(xù)培養(yǎng)至25 d，顆粒狀小凸起逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殄F狀，培養(yǎng)至35 d，錐狀體生長并伸長為不定芽(圖1b)，培養(yǎng)至45 d，愈傷組織分化出大量的不定芽，不定芽高度可達(dá)1.50 cm以上(圖1c)，平均分化率可達(dá)99.9%，在估計(jì)區(qū)間內(nèi)，且比表2中12個(gè)水平的分化率均高。可見，鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織芽苗再分化的最佳培養(yǎng)基為：DR+ZT3.35 mg·L-1+IAA0.05 mg·L-1+KT1.90 mg·L-1。

表1 影響鹿角杜鵑愈傷組織誘導(dǎo)主要因素的U10(102)試驗(yàn)

2.3 培養(yǎng)基中影響鹿角杜鵑再生芽苗生根的主要因素篩選

由表4中試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)和回歸分析結(jié)果(表2)可知，檢驗(yàn)值 Ft＞臨界值 F(0.05，2，9)，表明回歸方程有意義。同理，根據(jù)回歸方程獲知，激動(dòng)素和吲哚丁酸的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為0.20和0.05 mg·L-1，計(jì)算生根率的最優(yōu)解析解為93.6%，同2.1中公式計(jì)算得優(yōu)化值估計(jì)區(qū)間為86.53%～101.67%。通過回歸分析可知，激動(dòng)素和吲哚丁酸均與生根率呈負(fù)相關(guān)。猜測激動(dòng)素質(zhì)量濃度在0.20 mg·L-1和吲哚丁酸在0.05 mg·L-1以下有較高的生根率，又以激動(dòng)素質(zhì)量濃度為0～0.20 mg·L-1，以及吲哚丁酸質(zhì)量濃度為0～0.05 mg·L-1做了6個(gè)水平的補(bǔ)充試驗(yàn)，重復(fù)3次。結(jié)果表明，激動(dòng)素質(zhì)量濃度為0.10 mg·L-1和吲哚丁酸質(zhì)量濃度為0.04 mg·L-1時(shí)芽苗生根率最高。因此，待2.2中誘導(dǎo)的再生芽苗長至2.00 cm左右時(shí)，在無菌條件下打開培養(yǎng)瓶將生長健壯的芽苗從芽團(tuán)上切下，轉(zhuǎn)接到附加激動(dòng)素0.10 mg·L-1和吲哚丁酸0.04 mg·L-1的1/4DR培養(yǎng)基中做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，再生芽苗培養(yǎng)7 d，在芽苗切口處有微小錐狀顆粒出現(xiàn)，培養(yǎng)15 d后錐狀顆粒逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨母F，培養(yǎng)至30 d根錐伸長為不定根，培養(yǎng)至40 d可形成5條以上含有側(cè)根的不定根(圖1d)，生根率達(dá)98.0%以上，在估計(jì)區(qū)間范圍內(nèi)，且比表4所列12個(gè)水平的生根率均高?？梢?，鹿角杜鵑再生芽苗生根的最佳培養(yǎng)基為：1/4DR+KT0.10 mg·L-1+IBA0.04 mg·L-1。

按照1.4中的方法，對生根培養(yǎng)基進(jìn)行改良，即為 1/4DR+KT0.10 mg·L-1+IBA0.04 mg·L-1+GA32.30 mg·L-1。再生植株含有葉腋的莖節(jié)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，腋芽逐漸萌發(fā)伸長生長，同時(shí)在莖段靠近切口的干部可發(fā)出3～5條不定根，苗高可達(dá)4.5 cm(圖1e)?？旆钡慕Y(jié)果表明，經(jīng)過38 d的培養(yǎng)后，每節(jié)段平均增殖7倍以上，植株再生率為96.5%。

表2 鹿角杜鵑離體培養(yǎng)和高效植株再生各階段的回歸分析結(jié)果

根據(jù)1.4中的方法，待芽苗生根后并長至3.00～4.00 cm以上時(shí)進(jìn)行移栽煉苗，鹿角杜鵑再生植株經(jīng)過煉苗后，12 d可揭去薄膜，成活率達(dá)98.5%以上(圖1f)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基DR+ZT2.60 mg·L-1+IAA0.75 mg·L-1對鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)的效果最好，當(dāng)玉米素和吲哚乙酸質(zhì)量濃度分別超過2.60 mg·L-1和0.75 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)的愈傷組織顏色變白且質(zhì)地松軟而失去分化能力，質(zhì)量濃度分別低于2.10 mg·L-1和0.30 mg·L-1時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率均低于58.0%;培養(yǎng)基 DR+ZT3.35 mg·L-1+IAA 0.05 mg·L-1+KT 1.90 mg·L-1對鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織再分化的效果最佳，玉米素質(zhì)量濃度低于2.60 mg/L和高于3.35 mg·L-1時(shí)愈傷組織芽苗分化率均下降，均在45.0%以下，說明低質(zhì)量濃度的玉米素滿足不了鹿角杜鵑愈傷組織芽苗的分化，而過高質(zhì)量濃度的玉米素對愈傷組織芽苗的分化起抑制作用。適宜質(zhì)量濃度的吲哚乙酸有利于芽苗的生長。在培養(yǎng)基中附加KT1.90 mg·L-1，分化的芽苗比未附加的粗壯、長勢好且分化速度快［8］;在添加激動(dòng)素0.10 mg·L-1和吲哚丁酸0.04 mg·L-1的1/4DR培養(yǎng)基中對鹿角杜鵑愈傷組織再分化芽苗進(jìn)行生根培養(yǎng)的結(jié)果表明，生根速度快，平均生根率高達(dá)98.0%以上，吲哚乙酸對鹿角杜鵑的生根影響不顯著。當(dāng)吲哚丁酸低于0.04 mg·L-1時(shí)芽苗生根率僅為57.0%，高于0.15 mg/L時(shí)，芽苗基部膨脹并產(chǎn)生愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)根從愈傷組織上產(chǎn)生，含有這樣根的苗在煉苗移栽時(shí)根隨愈傷組織從苗基部脫落，成活率極低，原因可能是根中和苗莖的疏導(dǎo)組織連接錯(cuò)位導(dǎo)致的，Danielle等［9］的研究也發(fā)現(xiàn)了這一缺點(diǎn)。高效快繁采取再生植株莖節(jié)增殖的方式，在生根培養(yǎng)基中附加2.30 mg·L-1的赤霉素有利于腋芽快速萌發(fā)和生長［10］，從而縮短了莖節(jié)的增殖周期，提高了增殖倍數(shù)，該方法與王雯雯等［11］開展的大字杜鵑快繁研究有共同點(diǎn)。該方法成本低，簡捷而可操作性強(qiáng)，可用于工廠化育苗。

表3 影響鹿角杜鵑愈傷組織再生芽苗分化主要因素的U12(123)試驗(yàn)

鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)過程中，對玉米素和吲哚乙酸進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)可知，玉米素和吲哚乙酸均對愈傷組織誘導(dǎo)率影響顯著。由回歸分析結(jié)果計(jì)算出玉米素和吲哚乙酸對回歸的貢獻(xiàn)率分別為74.3%和31.0%，說明玉米素對愈傷組織的誘導(dǎo)率的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吲哚乙酸，可見玉米素對鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)的貢獻(xiàn)大于吲哚乙酸，說明玉米素在鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)中起主導(dǎo)地位，鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織是嫩葉細(xì)胞脫分化后經(jīng)增殖形成的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞的增殖主要依賴于玉米素的細(xì)胞分裂和分化作用，吲哚乙酸在嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)中促進(jìn)嫩葉細(xì)胞的脫分化;嫩葉愈傷組織再分化過程中，通過顯著性檢驗(yàn)可知，玉米素、吲哚乙酸和激動(dòng)素對愈傷組織分化率影響均顯著，貢獻(xiàn)率分別是19.7%、9.76% 和 10.2%，可見玉米素對愈傷組織芽苗再分化率的貢獻(xiàn)大于吲哚乙酸和激動(dòng)素，說明玉米素在鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織芽苗的再分化中起主要作用，這一點(diǎn)體現(xiàn)了玉米素對植物細(xì)胞功能分化的作用，吲哚乙酸和赤霉素分別促進(jìn)了再生芽苗的生長和伸長;在鹿角杜鵑再生芽苗生根過程中，同理，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)可知，激動(dòng)素和吲哚丁酸兩個(gè)因素對生根率影響顯著，而吲哚乙酸對生根率影響不顯著，激動(dòng)素和吲哚丁酸對生根的貢獻(xiàn)率分別為86.3%和13.7%，表明激動(dòng)素對再生芽苗的生根貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吲哚丁酸，這說明鹿角杜鵑試管苗的生根對激素具有選擇性，生根所需的生長素主要依賴于吲哚丁酸，輔以適當(dāng)濃度的激動(dòng)素有利于植物細(xì)胞趨于根器官功能的分化，并且在鹿角杜鵑生根中激動(dòng)素其決定性作用。本試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)說明了每種植物對不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)都具有不同程度的選擇性［12］，這可能是由植物自身的基因型控制的，而基因型不同又決定了細(xì)胞分裂、分化和器官重建所依賴的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類及其質(zhì)量濃度高低有所不同。

表4 影響鹿角杜鵑生根主要因素的U12(123)試驗(yàn)

目前，國外有許多野生杜鵑優(yōu)良品種已通過人工繁殖并馴化為園藝栽培種。我國野生杜鵑品種眾多，但人工繁殖并開發(fā)利用極少。鹿角杜鵑是我國珍稀植物資源和園藝觀賞植物，至今未見推廣應(yīng)用。本結(jié)果建立了鹿角杜鵑嫩葉離體培養(yǎng)和高效植株再生體系。為鹿角杜鵑和其它野生杜鵑優(yōu)良品種的開發(fā)利用和工廠化育苗奠定基礎(chǔ)和提供方法。

圖1 鹿角杜鵑嫩葉離體培養(yǎng)和高效植株再生各階段的形態(tài)

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