刁林林，趙宏偉，王敬國，劉化龍，趙 雪，孫 健，鄒德堂

（1.東北農業(yè)大學水稻研究所，哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學大豆研究所，哈爾濱 150030）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)活全世界近一半的人口。然而水稻的許多重要農藝性狀都是多基因控制的數量性狀，受環(huán)境條件影響較大。盡管目前國際上遺傳育種工作者的大部分研究都圍繞數量性狀的改良，但要精確利用數量性狀育出優(yōu)質多抗的超高產品種還比較困難，其原因主要是數量性狀的遺傳基礎研究得不夠透徹。20世紀80年代以來，分子標記的興起和QTL定位方法的改進，為精細研究數量性狀提供了有效手段，使研究水稻各種農藝性狀的遺傳基礎成為了可能，可以使育種家們在作物的遺傳機理上提高水稻的產量與品質，為實現水稻的高產高質提供了大量的理論依據。在先前的研究中，已經對水稻的數量性狀進行了大量的定位研究。包括：產量、株高、抽穗期等重要性狀。Yu等用250個F2∶3家系，共檢測到32個影響產量及其構成因子的QTLs，并檢測到大量互作位點對產量及其構成因子有顯著作用[1]。鄭景生等用區(qū)間定位法分別檢測到3個控制水稻生育期、株高的QTL，還檢測到2個影響結實率和千粒重的QTLs[2]。馬大鵬等利用水稻重組自交系群體對產量相關性狀進行了QTL定位，共檢測到38個QTLs，各性狀QTL的累積表現貢獻率達21.3%～79.5%[3]。葉少平等在第12條染色體上檢測到了控制千粒重的QTL[4]。Zhuang等使用F2和F3群體對每穗實粒數，每穗穎花數等8個性狀進行了QTL定位，共檢測到44個QTLs，并討論了不同環(huán)境對QTL定位的影響[5]。Xing等利用重組自交系群體，對單株產量及其構成因子進行了QTL定位，共檢測到了29個主效QTLs[6]。但是，由于全球物種遺傳多樣性和數量性狀基因QTLs的特殊性，這方面的研究還需要不斷加強。傳統的研究主要是秈粳稻雜交為試驗材料，而秈粳稻雜交不適合與北方的種植條件，根據實際的生產要求，應更主要的是研究粳粳稻雜交育種。

本試驗以粳粳稻東農422與東農427雜交，所產生的F2∶3群體為試驗材料，利用在親本間表現明顯多態(tài)性的76對SSR引物對該群體進行多態(tài)性信息分析，QTL定位結果是最終在水稻的12條連鎖群上，共定位到28個控制水稻株高、千粒重、穗長、有效穗數、一次枝梗數、二次枝梗數及抽穗期的QTLs，這些試驗結果為后續(xù)的粳粳稻定位QTL提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以遺傳差別較大的生產推廣的優(yōu)質水稻品種東農422和東農427作為親本，雙親雜交所衍生的F2∶3群體共180份株系作為研究對象。

1.2 農藝性狀的調查

于2010年將供試材料種植于東北農業(yè)大學實驗實習基地。4月18日播種，5月15號移栽。隨機區(qū)組設計，單行區(qū)，每行種植40棵，常規(guī)栽培管理同一般田間生產。在每一行內隨機取3株，3次重復，調查各農藝性狀，取3次調查結果的平均值。

①株高（cm）：自地面量至一株中最高植株的穗頂（不包括芒）的高度。

②有效穗數（個）：有效穗標準為有10個灌漿籽粒以上視為有效分蘗，數單株的有效分蘗數。

③穗長（cm）：單株所有有效穗穗頸節(jié)到頂花穎尖長度的平均值。

④千粒重（g）：稱量單株內1 000粒飽滿谷粒重量。

⑤一次枝梗數（個）：計算全株內每一個穗的枝梗數（有兩粒谷粒以上的視為一次枝梗），再求其平均值。

⑥二次枝梗數（個）：計算全株內每一個穗的第二次枝梗數，再求其平均值。

⑦抽穗期調查（d）：從播種到抽穗的天數記為抽穗期。

1.3 分子標記分析及遺傳連鎖圖譜的構建

苗期在每一家系內隨機選取5株新鮮葉片，提取家系及親本樣品的總DNA[7]，共篩選SSR引物600對。利用篩選出的引物進行PCR擴增，反應總體積為 20 μL，體系包括3 μL的模板 DNA（25 ng·μL-1），2 μL 10×PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2（25 mmol·L-1），2 μL SSR 引物（12 ng·μL-1），0.2 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.3 μLTaq酶（5 U·L-1），ddH2O補足至20 μL，最后加入液體石蠟覆蓋體系。PCR擴增步驟包括94℃預變性6 min，94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，35個循環(huán)，4℃保存。

本研究將來源于親本東農422（父本）帶型記為A，來源于東農427（母本）帶型記為B，雙親雜合帶型記為H，缺失記為“-”。運用Mapmaker/Exp 3.0作圖軟件進行連鎖圖譜的構建，應用Group命令進行連鎖分析和分組（LOD=3.0），連鎖標記少于8個的用Compare命令進行優(yōu)化排序，多于8個的用Ripple命令排序，錯誤檢測水平設為1%，利用Kosambi函數將重組率轉換成遺傳圖距（cM），采用Mapchart2.1進行遺傳連鎖圖譜的繪制。

2 結果與分析

2.1 表型值分析

所考察的7個性狀的表型統計參數值和表型分布見表1。參照親本的各性狀表現，后代群體的各性狀表現多種多樣，具有兩親本的各種重組類型，并表現出許多超親現象，并呈連續(xù)分布，因此可以推測各性狀受多基因控制。這符合數量性狀的特點，適合于QTL作圖分析。

2.2 引物的篩選及多態(tài)率

根據網上公布的水稻分子遺傳圖譜，選覆蓋水稻12條染色體的600對SSR引物在東農422與東農427間進行多態(tài)性檢測，有76對引物在雙親間表現明顯多態(tài)性，平均多態(tài)性引物比率為12.8%，大多數引物對不能擴增出特異性條帶，或擴增條帶的重復性差，未納入多態(tài)性信息分析中，標記在連鎖群上的分布是不同的，其中分子標記最多的染色體為第6號染色體，其上有12個標記；最少的是12號染色體，其上有2個標記。其中篩選出多態(tài)性引物最多的染色體是Chr6和Chr7，每條染色體上分別有12和10對特異性引物。其中第7條染色體上篩選出來特異性引物的多態(tài)性引物比率最大為18.5%，而第12條染色體上篩選出來特異性引物的多態(tài)性標記比率最小，僅為4.7%。分子標記間的平均遺傳距離為31.36 cM，最遠的為88 cM，最近的為2.9 cM。標記間距離很大的區(qū)段還是普遍存在的，所以還需要更多的分子標記來加密遺傳圖譜，以減少圖距。

表1 7個性狀在雙親間的差異以及在F2∶3群體中的變異Table 1 Difference of seven traits between parents and among the F2∶3population from the cross of Dongnong422×Dongnong427

2.3 主要農藝性狀的QTL分析

對所考察的株高、千粒重、有效穗數、穗長、一次枝梗數、二次枝梗數及抽穗期進行QTL定位分析。

本研究在水稻的12個連鎖群上共檢測到28個QTLs，在第1、4、5、6、7、8、10、11和12號染色體上都有分布，單個表型貢獻率從3.13%～38.03%。其中主要集中在第6和7號染色上，其上分別檢測到8個QTLs和5個QTLs，且在這兩條染色體的相應區(qū)段上存在著同時控制多個性狀的QTL密集區(qū)。

由圖1、表2可知，共檢測到5個控制株高的QTLs，分別位于第1、4、5和10條染色體上，其單個貢獻率從5.71%～23.13%，其加性效應從-2.50到1.10。

共檢測到2個控制有效穗數的QTLs，都是位于第6條染色體上，分別位于第6條染色體的RM494-RM345與RM162-RM217的區(qū)間上，表型貢獻率分別為10.12%～9.63%。

共檢測到4個控制千粒重的QTLs，分別位于第6、第7、第8、第12條染色體上，其單個貢獻率從9.87%～27.88%，其加性效應從-3.02到1.87。

共檢測到6個控制穗長的QTLs，分別位于第5、第7、第8條染色體上，且在第8條染色體上的3個區(qū)段RM25-RM458，RM44-RM1345，RM1345-RM264檢測到了3個QTLs。

共檢測到2個控制一次枝梗數的QTLs，都是位于第6條染色體上，分別位于第6條染色體上的RM494-RM345與RM217-RM528的兩個區(qū)段內。其貢獻率分別為8.01%與23.03%。

本研究中分別在第1、第3、第6、第7、第11條染色體上定位出了影響水稻抽穗期的QTLs，表型貢獻率從3.13%～30.10%，加性效應從-0.02到0.43。

圖1 水稻農藝性狀的QTL定位Fig.1 Location of agronomic traits in rice

表2 水稻農藝性狀的QTL定位和效應分析Table 2 Effect analysis and QTL location of agronomic traits in rice

3 討論

水稻的株高是重要的農藝性狀之一，直接關系到水稻品種的株型，抗倒伏性，區(qū)域布局與產量構成。祝莉莉等利用水稻品系B50與秈稻品種明恢630為親本得到的重組自交系群體在第1與第7號染色體上檢測到控制株高的QTLs，總表型變異率達到74.9%[8]。Liu等利用IR64/Azucena的DH群體檢測到控制株高的15個QTLs，其中8個具有加性效應，1個QTL具有加性與環(huán)境的互作效應[9]。Jiang等利用珍汕97/武育粳2號的DH群體，定位了控制株高的12個QTLs，分別位于1、2、3、9號染色體上各1個QTLs，6、7、8、12號染色體上各2個QTLs，總共解釋53.9%的表形變異[10]。目前，已定位的水稻株高QTL已有900多個（http://www.gramene.org.cn），在12條染色體上都有分布，但主要集中在第1、2、3、4和5條染色體上。本試驗所得到的控制株高的QTLs主要分布在1、4、5、10號染色體上有相同的染色體分布。雖然能檢測到相同的染色體，但并沒有找到相同的分子標記，這說明了不同品系間的基因型差異。

利用分子標記進行水稻千粒重的QTL定位有不少的報道。Li等利用CSSLs群體在水稻的第3條染色體上檢測到影響千粒重的QTL[11]。Xie等在水稻的第8與第9條染色體上檢測到影響千粒重的QTL[12]。徐建龍等在9條染色體的l7個區(qū)域檢測到影響粒重及相關性狀的主效QTLs 48個[13]。李澤福等用Nipponbare Kasalath/nipponbare回交重組自交系檢測到的5個控制千粒重的QTLs，共解釋性狀變異的66.9%，分布在3條染色體上，單個QTL的貢獻率在6.6%～31.1%之間[14]。從以上對比結果來看，很多控制產量性狀QTL在不同的群體和環(huán)境中檢測的結果在各個染色體上都有分布，大不相同，但有交叉的部分。本研究在第4、第6、第7、第8、第12號染色體上檢測到影響千粒重的QTLs，前人的報道幾乎都可以檢測到。

穗長是水稻產量的重要構成因子之一，利用分子標記對穗長的QTL定位也有許多報道，但結果存在較大差異。Zhuang等利用F2和F3群體在第2和第8號染色體上檢測到2個影響穗長的QTLs基因。Lu等利用DH系群體在第6號染色體上檢測到1個影響穗長的QTL基因[15]。本研究中我們通過SSR標記進行穗長基因QTL定位，在第5、第7、第8號染色體上檢測到影響穗長的QTLs，在先前的報道中都有檢測到，也進一步豐富了穗長性狀QTL研究的成果，為穗長基因的精細定位提供了有力的佐證。

關于有效穗數的QTL報道較少，封功能等共檢測到12個QTLs，分布于第2、3、4、5、6、7、8、9、10號染色體上，其中qPN4-3既有加性效應，并且加性效應顯著[16]。Xiao等用9024/LH422重組自交系檢測到位于第4條染色體區(qū)段上的控制有效穗數的一個主效QTL（qPN-4）[17]。Liao等利用一個重組自交系群體，在兩種不同環(huán)境下共檢測到9個控制有效穗數的QTLs，其中有3個在不同環(huán)境中同時表達[18]。劉桂富等利用DH群體在水稻的第1、4、10、12條染色體上檢測到了影響穗數的4個QTLs[19]?？梢?，幾乎在各條染色體上都有關于控制有效穗數的QTL存在。本試驗中，只在第6條染色體上檢測到兩個影響水稻有效穗數的QTLs。

很多國內外研究者對一次枝梗數、二次枝梗數也有部分研究，Lin等在F2群體上檢測到在第8條染色體上1個對一次枝梗數貢獻率為20.9%的QTL[20]。陳順強等利用DH群體在第1、8及第10條染色體上的相應區(qū)段檢測到了3個控制一次枝梗數的QTLs，在第1和10兩條染色體檢測到了兩個控制二次枝梗數的QTLs[21]。本研究中只在第6條染色體上檢測到兩個控制一次枝梗數的QTLs，而且并沒有檢測到控制二次枝梗數的QTLs。這可能與試驗所用的材料、構建的群體，試驗環(huán)境不同有關。

水稻的抽穗期是重要的農藝性狀之一，對水稻抽穗期進行遺傳性分析有利于了解短日植株的開花習性和對水稻品種的改良。利用分子標記進行水稻抽穗期QTL定位已有不少研究報道，所定位出的控制抽穗期的QTLs在各個染色體上都有報道，但主要集中在第6、7和8條染色條上[22]。李仕貴等認為迄今已報道了28個控制水稻抽穗期的主效基因，則集中分布在水稻第6、第7、第10條染色體上[23]。Li等利用Lement/Teqing組合的F4群體定位了3個抽穗期QTL[24]。Yu等利用Zhanshan 97/Minghui 63的F2∶3代的240個家系檢測到6個抽穗期QTL和許多對抽穗期有顯著影響的互作QTL[1]。Zhou利用1個秈粳交組合的DH群體定位了19個抽穗期QTL[25]。本試驗是在第1、第3、第6、第7、第11號染色體上檢測到影響抽穗期的QTLs，這與前人報道的有交叉的染色體分布結果大體一致。

4 結論

本研究所得出的結果是在水稻的12條連鎖群上，共檢測到28個控制水稻株高、千粒重、穗長、有效穗數、一次枝梗數、二次枝梗數及抽穗期的QTLs，具體的定位結果如下：

①共檢測到5個控制水稻株高的QTLs，分別位于第1、第4、第5、第10條染色體上，其單個貢獻率5.71%～23.13%。

②共檢測到2個控制有效穗數的QTLs，都是位于第6條染色體上，貢獻率分別為10.12%與9.63%，其中位于RM494-RM345區(qū)段的QTL為主效QTL。

③共檢測到4個位于第6、第7、第8、第12條染色體上控制千粒重的QTLs，其單個貢獻率9.87%～57.88%。

④共檢測到6個分別位于第5、第7、第8條染色體上，控制穗長的QTLs，其中位于第8條染色體RM1345-RM264區(qū)段所檢測到的貢獻率達到34.42%。

⑤共檢測到2個都是位于第6條染色體上控制一次枝梗數的QTLs，分別位于第6條染色體上的RM494-RM345與RM217-RM276兩個區(qū)段內。其貢獻率分別為8.01%與23.03%。

⑥共檢測到9個位于第1、第3、第6、第7、第11條染色體影響水稻抽穗期的QTLs，表型貢獻率3.13%～50.10%。

[1] Yu S B,Li J X,Zhang Q F.Importance of epistasis as the eneticbasis of heterosis in an elite rihybrid[J]Proc Natl Sci USA,1997,94:9226-9231.

[2] 鄭景生,江良榮,曾建敏,等．應用明恢86和佳輻占得F2群體定位水稻部分重要農業(yè)性狀和產量構成的QTL[J]．分子植物育種,2003,1(5):633-639．

[3] 馬大鵬,羅利軍,汪朝陽,等.利用重組自交系群體對水稻產量相關性狀的QTL分析[J].分子植物育種,2004,2(4):507-522.

[4] 葉少平,張啟軍．用培矮64S與日本晴F2群體對水稻6個農藝性狀的QTL定位[J]．中國水稻科學,2007,21(1):39-43．

[5] Zhang J Y,Lin H X,Lu J.Analysis of QTL×environment interaction for yield components and plant height in rice[J].Theor Appl Genet,1997,95(5-6):799-808.

[6] Xing Y Z,Tan Y F,Hua J P,et al.Characterization of the main effects,epistatic effects and their environmental interactions of QTLs on the genetic basis of yield traits in rice[J].Theoretical and Applied Genetics,2002,105(2-3):248-257.

[7] 王關林,方宏筠．植物基因工程[M]．北京:科學出版社,2009:438．

[8] 祝莉莉,譚光軒,任翔,等．5種重要農藝性狀基因在水稻重組自交系群體中的定位[J]．武漢大學學報:理學版,2003,49(6):787-792．

[9] Liu H X,Zhuang Y J,Qian R H.Mapping QTL for plant height and its components by molecular markers in rice(Orya sativaL.)[J].Acta Agronconica Sinica,1996,22:257-263.

[10] Jiang G H,Liang G H,Zhai W X,et al.Genetic mapping of a new semi-dwarf gene,sd-t(t),in indica rice and estimating of the physical distance of the mapping region[J].Science in China Series C-Life Sciences,2002,45(4):388-396.

[11] Li S G,Ma Y Q,Wang W M,et al.Molecular tagging of a new recessive gene for late heading in a rice cultivar 8987[J].Acta Genetica Sinica,2000,27(2):133-138.

[12] Xie X,Song M H,Jin F,et al.Fine mapping of a grain weight quantitative trait locus on rice chromosome 8 using near-isogenic lines derived from a cross betweenOryza sativaandOryza rufipogon[J].Tag Theoretical and Applied Genetics Theoretische and Angewandte Genetik,2006,113(5):885-894.

[13] 徐建龍,薛慶中,羅利軍,等.水稻粒重及其相關性狀的遺傳解析[J].中國水稻科學,2002,16(1):6-10.

[14] 李澤福,夏加發(fā),蘇澤勝,等．水稻產量及其相關性狀的數量性狀基因座分析[J]．南京農業(yè)大學學報,2002,25(2):1-6．

[15] Lu C,Shen L,He P,et al.Comparative mapping of QTLs for agronomic traits ofrice acrossenvironments by using a doubled-haploid population[J].Tag Theoretical and Applied Genetics Theoretische and Angewandte Genetik,1997,94(1):145-150.

[16] 封功能．水稻釉粳交DH群體產量相關性狀的QTL定位和上位性分析[J]．揚州大學學報,2004,25(2):24-26.

[17] Xiao J,Yuan L,Tanksleys.Identification of QTL affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross[J].Theor Appl Genet,1996,92:230-244.

[18] Liao C Y,Wu P,Hu B,et al.Effects of genetic background and environment on QTLs and epistasis for rice(Oryza sativaL.)panicle number[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,103(1):104-111.

[19] 劉桂富,盧永根．水稻產量,株高及其相關性狀的QTLs定位[J]．華南農業(yè)大學學報,1998,19(3):5-9．

[20] Lin H X,Qian H R,Zhuang J Y,et al.RFLP mapping of QTLs for yield and related characters in rice(Oryza sativaL.)[J].Theor Appl Genet,1996,92:920-927.

[21] 陳順強,汪洋,章志宏,等.用RFLP標記剖析水稻穗頸維管束及穗部性狀的遺傳基礎[J].武漢植物學研究,2004,22(1):15-21.

[22] 李澤福,周彤,鄭天清,等．水稻抽穗期QTL與環(huán)境互作分析[J].作物學報,2002,28(6):771-776．

[23] 李仕貴,馬玉清,何平,等．不同環(huán)境條件下水稻生育期和株高的QTL分析[J]．作物學報,2002,28(4):546-550．

[24] Li J,Thomson M,Mccouch S R.Fine mapping of a grain-weight quantitative trait locus in the pericentromeric region of rice chromosome 3[J].Genetics,2004,168(4):2187-2195.

[25] Zhou L Q.Genetica dissection of heading time and its components in rice[J].Theor Appl Genetica,2001,102:1236-1242.