劉 濤，王 瑞，曲哲會(huì)，連慧香，魏愛(ài)枝

（信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校，河南 信陽(yáng) 464000）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的仔豬的一組腸道傳染性疾病，常見(jiàn)的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫3種。以發(fā)生腸炎、腸毒血癥為特征.主要發(fā)生在0～70日齡的仔豬。大腸桿菌病屬于條件性致病菌，當(dāng)環(huán)境因素惡劣或機(jī)體抵抗力下降時(shí)，容易引發(fā)該病的發(fā)生，尤其是冬季，天氣寒冷，氣溫劇變，保溫不良，空氣流通不暢，更易引發(fā)此病，造成新生仔豬大批死亡或生長(zhǎng)發(fā)育不良，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)豬戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年2月到11月期間，我們對(duì)信陽(yáng)地區(qū)存欄母豬在100頭以下的中小型養(yǎng)豬場(chǎng)開(kāi)展了豬大腸桿菌病血清型流行病學(xué)調(diào)查工作。

1 材料與方法

1.1 病料 采自2010年以來(lái)河南省信陽(yáng)地區(qū)平橋區(qū)、浉河區(qū)、羅山縣、光山縣、固始縣、潢川縣、新縣156個(gè)發(fā)生豬大腸桿菌病的中小型養(yǎng)豬場(chǎng)；其中，肛門(mén)拭子120份，病豬空腸和小腸內(nèi)容物100份，共計(jì)220份。

1.2 診斷試劑 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O型血清，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、S.S.瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司提供。微量生化反應(yīng)管，青島海博生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)小鼠（清凈級(jí)），信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供。

1.4 主要儀器 THZ-92C型臺(tái)式恒溫振蕩器，E-200型數(shù)碼攝影顯微鏡，PHS25型數(shù)顯式酸度計(jì)，DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱，WGP-300隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，7230型紫外分光光度計(jì)，LDZX-50KBS型不銹鋼全自動(dòng)數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌器，SW-CJ-ZF型超凈工作臺(tái)，DW-L 中科美菱超低溫冰箱。

1.5 分離培養(yǎng) 病料分別接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、麥康凱平板，置37℃培養(yǎng)24h；涂片，革蘭染色鏡檢，挑取培養(yǎng)基上的典型單個(gè)菌落，依次接種于麥康凱瓊脂平板、肉湯，進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.6 生化試驗(yàn) 取純培養(yǎng)菌落接種生化反應(yīng)管，于37℃培養(yǎng)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行生化反應(yīng)試驗(yàn)。

1.7 血清型鑒定 將經(jīng)生理生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌的純培養(yǎng)菌株于普通瓊脂培養(yǎng)，用2mL0.5%石碳酸生理鹽水洗下以后，以2000r／min離心5 min；取其上清液，8000r／min離心10min；取其沉淀物配成菌懸液，再經(jīng)121℃處理2h，破壞K抗原，即為O抗原；4℃保存，備用。按照大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O血清凝集試驗(yàn)使用說(shuō)明書(shū)操作。鑒定發(fā)病場(chǎng)豬大腸桿菌致病菌株血清型。

1.8 致病性試驗(yàn) 將鑒定的大腸埃希氏菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，4000r／min離心20min，用等量滅菌生理鹽水配制懸浮液作攻毒用。將27只小鼠，分為9組，每組3只。8個(gè)組為試驗(yàn)組，1個(gè)組作為對(duì)照，試驗(yàn)組腹腔注射懸浮液0.2mL／只。注射后每6h觀察1次，連續(xù)觀察72 h，剖檢死亡小鼠，取肝臟，抹片，革蘭染色鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查 對(duì)2010年以來(lái)河南省信陽(yáng)地區(qū)156個(gè)發(fā)生豬大腸桿菌病的養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢查、病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷。結(jié)果發(fā)生疫情的豬群總存欄數(shù)為20656頭，總發(fā)病豬4738頭，病死943頭，平均發(fā)病率為22.93% ，平均病死率為19.90%。其中，仔豬黃痢93次，發(fā)病豬3190頭，病死542頭，平均發(fā)病率為15.44%，平均病死率為16.99%；仔豬白痢43次，發(fā)病豬934頭，病死128頭，平均發(fā)病率為4.52%，平均病死率為13.7%；仔豬水腫20次，發(fā)病豬614頭，病死72頭，平均發(fā)病率為2.97%，平均病死率為11.72%（見(jiàn)表1）。

表1 信陽(yáng)地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)豬大腸桿菌病流行情況

2.2 分離培養(yǎng) 共分離獲得70株大腸桿菌（見(jiàn)表2）。其在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成為中等大小、圓形微凸、表面光滑濕潤(rùn)、淺灰色半透明菌落；在血液瓊脂上出現(xiàn)菌落較大，有黏性邊緣整齊，并有隆起的灰白色菌落，不溶血或β溶血；在麥康凱平板上，形成周邊粉紅中心深紅色菌落；分離菌接種普通肉湯呈均勻混濁，管底有淡白色黏稠沉淀，輕搖呈云霧狀散開(kāi)，并有糞臭味。

表2 大腸桿菌分離結(jié)果

2.3 生化試驗(yàn) 分離到的細(xì)菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，能使麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能發(fā)酵肌糖、木糖，不能利用枸櫞酸，V-P試驗(yàn)（一），M.R.試驗(yàn)（+）。

2.4 血清型鑒定 仔豬黃痢病料分離菌株血清型分別為 O8（4株）、O9（4株）、O60（2株）、O64（2株）、O115（1株）、O149（9株）、O157（18株），仔豬白痢病料分離菌株血清型分別為 O8（6株）、O9（2株）、O139（1株）、O157（11株），仔豬水腫病料分離菌株血清型分別為 O2（1株）、O8（1株）、O139（3株）、O157（5株）。

2.5 致病性試驗(yàn) 接種后6h，接種O8，O9，O157的9只小鼠全部發(fā)病；24h后，接種O149的3只小鼠全部發(fā)病，接種O60，O64的6只小鼠中各有2只發(fā)?。?2h后，除接種O115的3只小鼠未發(fā)病外，接種試驗(yàn)組小鼠全部發(fā)病。發(fā)病小鼠出現(xiàn)稀便，沉郁，呼吸加快，肛門(mén)周?chē)幻栉?；其中，接種 O8，O9，O60，O157，O139，O64菌株小鼠全部死亡，對(duì)照組和接種O115組小鼠未出現(xiàn)死亡。死亡小鼠肝涂片，革蘭染色、鏡檢，結(jié)果與分離菌株鏡檢結(jié)果相同（見(jiàn)表3）。

表3 各血清型大腸桿菌致病性試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 對(duì)2010年以來(lái)河南省信陽(yáng)地區(qū)156個(gè)發(fā)生豬大腸桿菌病的養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行了血清型流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢查、病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷。結(jié)果發(fā)生疫情的豬群總存欄數(shù)為20656頭，總發(fā)病豬4738頭，病死943頭，平均發(fā)病率為22.93% ，平均病死率為19.90%。其中，仔豬黃痢93次，發(fā)病豬3190頭，病死542頭，平均發(fā)病率為15.44%，平均病死率為16.99%；仔豬白痢43次，發(fā)病豬934頭，病死128頭，平均發(fā)病率為4.52%，平均病死率為13.7%；仔豬水腫20次，發(fā)病豬614頭，病死72頭，平均發(fā)病率為2.97%，平均病死率為11.72%。表明致病性大腸桿菌引起的仔豬黃痢和仔豬白痢為河南省信陽(yáng)地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬腹瀉性疾病和死亡的重要原因。

3.2 血清型鑒定共檢出8種O抗原血清型，動(dòng)物試驗(yàn) O8，O9，O60，O64，O149，O157，O139血清型接種小鼠全部發(fā)病和致死。這一結(jié)果表明，信陽(yáng)地區(qū)流行的豬大腸桿菌病血清型復(fù)雜，在防治本病時(shí)應(yīng)充分注意，選擇疫苗應(yīng)與本地流行血清型相對(duì)應(yīng)，有條件的豬場(chǎng)應(yīng)進(jìn)行血清型的診斷，或采用本地（場(chǎng)）菌株制造滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。

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