劉丹，韓飛，禮嵩，畢開(kāi)順，陳曉輝#（.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)006；.沈陽(yáng)藥大藥業(yè)有限公司，沈陽(yáng) 006）

鴉膽子油為苦木科植物鴉膽子Brucea javanica（L.）Merr.的干燥成熟果實(shí)經(jīng)石油醚提取得到的脂肪油，其主要成分[1～7]為棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸。鴉膽子油乳注射液是鴉膽子油與乳化劑制成的滅菌乳狀液，臨床常用于肺癌、肺癌腦轉(zhuǎn)移及消化道腫瘤等多種惡性腫瘤的治療[2]，該藥與化療藥合用時(shí)可提高療效，毒副反應(yīng)少[3]。一般認(rèn)為鴉膽子油制劑的臨床療效與其含有豐富的不飽和多烯脂肪酸有密切關(guān)系[4]，其中油酸具有很強(qiáng)的抗癌活性[5]，其他的脂肪酸成分也對(duì)人體具有重要的平衡調(diào)節(jié)作用，是不可缺少的物質(zhì)，在降血脂、抗腫瘤、營(yíng)養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用。建立多指標(biāo)成分含量測(cè)定對(duì)中藥質(zhì)量控制具有重要意義。因此，筆者采用毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測(cè)定鴉膽子油乳注射液中棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的含量[6]，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 7890A型氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測(cè)器、DB-WAX型色譜柱（美國(guó)Agilent科技有限公司）；BP210S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋；SGK-5LB型氫氣發(fā)生器；HGC-36A型氮吹儀。

油酸對(duì)照品（美國(guó)sigma公司，含量≥99%）；亞油酸對(duì)照品（美國(guó)sigma公司，含量≥99%）；棕櫚酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190029-201001）；硬脂酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190032-201001）；內(nèi)標(biāo)物苯甲酸苯酯（上海西域機(jī)電系統(tǒng)有限公司，含量≥98%）；鴉膽子油乳注射液（沈陽(yáng)藥大藥業(yè)有限公司，批號(hào)：11030411、10081311、10092911、10102411）；正己烷、甲醇和丙酮（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，均為色譜純）；三氟化硼乙醚（成都市科龍化工試劑廠，分析純）；氯化鈉、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），柱溫：200℃恒溫，保持11 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測(cè)器溫度：250℃；流速：1.0 mL·min－1；分流比：20∶1；載氣：高純氮；進(jìn)樣量：1 μL。在該色譜條件下，取對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。理論板數(shù)按油酸甲酯計(jì)算不低于3.0×104。棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯色譜峰分離度良好，與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取苯甲酸苯酯約100 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加正己烷定容至刻度，搖勻，制備成濃度為0.975 mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一50 mL容量瓶中，加正己烷定容至刻度，搖勻，制備成棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的濃度分別為0.335 4、0.223 8、2.923 0、0.964 0 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品約1.2 g，精密稱定，置于50 mL圓底燒瓶中，加稀鹽酸10滴，搖勻，加氯化鈉1.0 g，于65℃水浴中加熱30 min，至油水分離，取出放冷至室溫，精密加入正己烷振搖提取3次，每次5 mL，合并正己烷提取液，置于25 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度。精密吸取正己烷溶液2 mL，置于10 mL具塞試管中，吹干，精密加入丙酮2 mL，振搖后，離心，取上層溶液l mL，置于10 mL具塞試管中，吹干。加入0.5 mol·L－1氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，置于60℃水浴皂化25 min至油珠全部消失，放冷，加15%三氟化硼乙醚甲醇溶液2 mL，置于60℃水浴酯化2 min，放冷，精密加入正己烷2 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，振搖，靜置。取上層溶液，加0.4 g無(wú)水硫酸鈉，除去微量水。精密量取上層溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各l mL，搖勻，取1 μL注入氣相色譜儀，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取處方量的制劑輔料，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取陰性樣品溶液適量，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。在棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯及亞油酸甲酯位置均未出峰，表明制劑輔料不干擾測(cè)定?；旌蠈?duì)照品、樣品及陰性樣品溶液色譜見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于具塞玻璃試管中，照“2.2.3”項(xiàng)下制備方法，制成系列混合對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品溶液濃度（X，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯的回歸方程分別為Y＝0.683 8X+0.014 8（r＝0.999 6）、Y＝0.731 6X+0.009 4（r＝0.999 7）、Y＝0.518 0X+0.073 0（r＝0.999 2）、Y＝0.646 6X+0.031 0（r＝0.999 1）。結(jié)果表明，棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯檢測(cè)濃度分別在0.084～0.839、0.056～0.560、0.731～7.31、0.241～2.41 mg·mL－1范圍內(nèi)與其內(nèi)標(biāo)峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

圖1 氣相色譜圖A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.棕櫚酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.油酸甲酯；4.亞油酸甲酯；5.苯甲酸苯酯Fig 1 GC chromatogramA.reference substance；B.sample；C.negative samples；1.methyl hexadecanoate；2.methyl octadecanoate；3.methyl oleate；4.methyl linoleate；5.phenyl benzoate

精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的RSD分別為0.8%、1.1%、1.1%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取鴉膽子油乳注射液適量，各6份，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法操作，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果，棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的RSD分別為2.0%、2.2%、2.4%、3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果，棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的RSD分別為1.2%、2.5%、2.1%、2.1%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取鴉膽子油乳注射液（批號(hào)：11030411）共9份，每份約0.6 g，精密稱定，分別精密加入相當(dāng)于樣品含量80%、100%、120%濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法操作，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表1～表4。

表1 棕櫚酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test of palmitic acid（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

取鴉膽子油乳注射液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定含量，結(jié)果詳見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 不同極性色譜柱及程序升溫的方式

分別考察了DB-1、DB-1701和DB-WAX型3種不同極性的毛細(xì)管柱。結(jié)果表明，DB-WAX型石英毛細(xì)管柱能夠?qū)悠犯鞔郎y(cè)組分實(shí)現(xiàn)良好的分離。試驗(yàn)曾采用80～230℃程序升溫的方式，最后確定200℃恒溫測(cè)定時(shí)色譜峰達(dá)到基線分離，出峰時(shí)間合適且拖尾因子符合要求。

表2 硬脂酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2Results of recovery test of octadecanoic acid（n＝9）

表3 油酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3Results of recovery test of oleic acid（n＝9）

表4 亞油酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 4Results of recovery test of linoleic acid（n＝9）

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）Tab 5Results of content determination of samples（%，n＝3）

3.2 影響供試品溶液制備的因素

筆者采用單因素循環(huán)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以各待測(cè)組分含量為檢測(cè)指標(biāo)，分別考察了注射液破乳后水浴的時(shí)間（15、30、60 min），甲酯化中使用的氫氧化鉀甲醇的濃度（0.2%、0.5%、1%）和酯化時(shí)間（1、2、5 min），得最佳衍生化工藝條件為：破乳后水浴30 min，加入0.5%氫氧化鉀甲醇溶液皂化，再加入15%三氟化硼乙醚甲醇溶液水浴酯化2 min。在從注射液中破乳提取鴉膽子油的過(guò)程中，最后使用丙酮溶解樣品，從而除去不溶于丙酮的乳化劑豆磷脂的干擾，有效地提純了樣品溶液。

3.3 注射液中輔料對(duì)脂肪酸含量測(cè)定的影響

通過(guò)制備陰性樣品溶液，在“2.1項(xiàng)”色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果，在棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯及亞油酸甲酯位置均未出峰，表明制劑輔料不干擾測(cè)定。

3.4 中藥注射液成分復(fù)雜，靜脈滴注直接進(jìn)入血液，需要嚴(yán)格控制其質(zhì)量

現(xiàn)行部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)總酸量（以油酸作為指標(biāo)成分）進(jìn)行測(cè)定，不能全面反應(yīng)中藥的質(zhì)量控制。因此，建立多指標(biāo)成分含量測(cè)定對(duì)中藥注射劑的質(zhì)量控制具有重要意義。本試驗(yàn)采用毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)對(duì)鴉膽子油乳注射液中的4種脂肪酸類成分進(jìn)行了定量分析，其中抗癌活性成分油酸含量均能達(dá)到5%以上，不同批次略有差別，其他幾種脂肪酸也均能達(dá)到預(yù)期含量。

綜上所述，該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為鴉膽子油乳注射液的質(zhì)量控制提供參考。

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