高曉猛，張春雷，房興堂，陳 宏＊，2

（1.江蘇師范大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，江蘇 徐州 221116；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

Grb7家族（growth factor receptor－bound protein 7family，生長(zhǎng)因子受體銜接蛋白7家族）受體分子包括 Grb7（growth factor receptor－bound protein 7，生長(zhǎng)因子受體銜接蛋白7），Grb10（growth factor receptor－bound protein 10，生長(zhǎng)因子受體銜接蛋白10）和Grb14，它們每一個(gè)都有若干個(gè)剪接變體。像其它受體分子一樣，Grb7家族蛋白功能是在調(diào)節(jié)不同細(xì)胞功能上，間接把多樣的細(xì)胞表面受體結(jié)合到下游區(qū)信號(hào)途徑。它們?cè)谛蛄猩嫌酗@著的同一性。本文僅就其中的一個(gè)生長(zhǎng)因子GRB14的研究現(xiàn)狀做一個(gè)介紹。

1 GRB14的基本結(jié)構(gòu)和染色體定位

目前對(duì)Grb14的結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)研究的比較清楚。通過(guò)比較Grb7／10／14三個(gè)成員之間的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們之間存在顯著的序列同一性，存在一個(gè)保守的分子結(jié)構(gòu)。Grb14在結(jié)構(gòu)上包括三個(gè)部分：羧基末端存在一個(gè)高度保守的SH2區(qū)域，中央存在一個(gè)稱為GM（Grb／Mig）的區(qū)域，氨基末端包含一個(gè)保守性很強(qiáng)的區(qū)域，此區(qū)域富含脯氨酸。

grb14基因在人體上定位于第2號(hào)染色體的2q22－q24區(qū)［1］，含有14個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)生具有540個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)［2，3］。人grb14基因的mRNA在肝臟，腎臟，胰臟，卵巢，睪丸，心臟和骨骼肌中高度表達(dá)，而且也大量存在于腎胚胎細(xì)胞，一些前列腺癌細(xì)胞系和乳癌細(xì)胞中［4］，顯著存在于ER－陽(yáng)性 細(xì) 胞 系 中［4，5］。grb14 基 因 有 三 種 剪 接 變 體（2.3kb，2.4kb和2.5kb）［4］。黑猩猩和小鼠的grb14基因定位于第2號(hào)染色體上，大鼠的grb14基因定位于第3號(hào)染色體上［2］。在小鼠和大鼠上grb14基因編碼產(chǎn)生538個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，在對(duì)胰島素敏感的器官如肝臟，心臟，骨骼肌，胰臟，腦和白脂肪組織中表達(dá)，能夠產(chǎn)生2.5kb和1.9kb的剪接變體［6］。小鼠grb14基因序列與大鼠相比有93%的相似性，和人體grb14基因序列有85%的相似性［7］。牛的grb14基因定位于第2號(hào)染色體，編碼產(chǎn)生540個(gè)氨基酸，128 975bp，含有5＇UTR 176 bp，CDS區(qū)1 623bp，3＇UTR 850bp。

2 GRB14的功能及其相應(yīng)機(jī)理

2.1 GRB14在胰島素活性上的作用

2.1.1 GRB14抑制胰島素受體的催化活性

GRB14在小鼠肝臟與胰島素受體結(jié)合后，胰島素顯示出的強(qiáng)烈興奮可以證明在胰島素信號(hào)上GRB14能夠起作用。目前發(fā)現(xiàn)到GRB14能夠特異性地結(jié)合到胰島素受體酪氨酸激酶環(huán)上，導(dǎo)致有可能這種相互作用會(huì)改變這些受體的催化活性。Bereziat等［8］在體外進(jìn)行了酪氨酸激酶的分析實(shí)驗(yàn)，證明GRB14通過(guò)改變受體的自磷酸化作用能直接抑制胰島素受體對(duì)底物的催化活性。Bereziat和Stein等［8，9］研究了GRB14蛋白和胰島素受體結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)胰島素受體的催化活性的抑制，是由于它結(jié)合到了GRB14的PIR結(jié)構(gòu)域（位于中央GM區(qū)）上，而不是獨(dú)自結(jié)合到SH2區(qū)域，同樣對(duì)于GRB7和GRB10來(lái)說(shuō)負(fù)責(zé)抑制IR酪氨酸激酶活性的也是PIR結(jié)構(gòu)域。這就說(shuō)明結(jié)合能力與PIR結(jié)構(gòu)域抑制作用之間的聯(lián)系，說(shuō)明GRB14在調(diào)節(jié)胰島素受體催化活性上起到中樞作用。Bereziat和Stein等［8，9］在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了GRB7和GRB10也抑制胰島素受體催化活性，但是要比GRB14的效應(yīng)差。綜合考慮這些發(fā)現(xiàn)表明GRB14在胰島素受體催化活性上具有特殊的抑制效應(yīng)。

2.1.2 GRB14對(duì)細(xì)胞內(nèi)胰島素活性的作用

Saltiel等［10］指出，在胰島素結(jié)合到相應(yīng)受體上后，細(xì)胞內(nèi)胰島素活性的第一步是誘導(dǎo)胰島素受體的酪氨酸殘基進(jìn)行自磷酸化作用。然后這些殘基就作為細(xì)胞內(nèi)特異效應(yīng)器的結(jié)合位點(diǎn)，比如胰島素受體家族或含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，從而使胰島素信號(hào)得以傳遞。Bereziat等［8］指出在GRB14蛋白存在時(shí)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2的活性會(huì)被降低。因此，可以得出結(jié)論，GRB14蛋白在胰島素受體催化活性上的直接抑制效應(yīng)有可能是在胰島素信號(hào)的早期階段。

Bereziat等［8］在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢－胰島素受體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，如果過(guò)表達(dá)GRB14蛋白將會(huì)導(dǎo)致胰島素受體的持續(xù)磷酸化，它會(huì)維持在最高水平高達(dá)90 min。一種解釋是GRB14蛋白與活化的胰島素受體結(jié)合，會(huì)在空間上妨礙酪氨酸磷酸酶的活性，比如PTP1B（protein tyrosine phosphatase1B，蛋白酪氨酸磷酸酶1B），因此才使胰島素受體維持在一個(gè)磷酸化的狀態(tài)。綜合得出GRB14和PTP1B是通過(guò)兩種不同的機(jī)制來(lái)降低胰島素受體的催化活性：PTP1B通過(guò)脫磷酸作用使胰島素受體失去活性，而GRB14是通過(guò)結(jié)合磷酸化的酪氨酸激酶環(huán)來(lái)直接抑制它的催化活性。Cariou等［11］把GRB14顯微注射進(jìn)入非洲蟾酴卵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)可以阻斷胰島素誘導(dǎo)的減數(shù)分裂。如果把蛋白激酶C zeta干擾蛋白（ZIP）一起注射進(jìn)入細(xì)胞的話，就會(huì)出現(xiàn)GRB14的抑制作用。這種效應(yīng)需要蛋白激酶C zeta的募集反應(yīng)。因此，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的胰島素信號(hào)負(fù)反饋通路（圖1）。

圖1 grb14介導(dǎo)胰島素信號(hào)抑制作用時(shí)ZIP的作用模型（來(lái)自參考文獻(xiàn)［11］）

2.2 GRB14在纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑上的作用

纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）是一個(gè)超過(guò)20多個(gè)生長(zhǎng)因子的家族，是脊椎動(dòng)物發(fā)育，組織生長(zhǎng)和發(fā)育的決定性調(diào)節(jié)器。Grose等［12］指出FGFs的突變或者表達(dá)和活性的失調(diào)都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生發(fā)育異常和腫瘤發(fā)生。FGF信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)一個(gè)含有四種跨膜酪氨酸激酶家族來(lái)完成。Eswarakumar等［13］發(fā)現(xiàn)通過(guò)配體之間的結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)受體形成二聚體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)中酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化和激活作用，然后就會(huì)出現(xiàn)多方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。如果加入靶蛋白，那么它們之間就會(huì)通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域和活化受體的特殊磷酸化酪氨酸殘基相互作用。

Bertrand Cariou等［14］指出，纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）是繼胰島素受體之后的第二個(gè)在細(xì)胞中能夠與GRB14相互作用的受體酪氨酸激酶。像胰島素那樣，GRB14的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制由纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增生，并且發(fā)現(xiàn)了不能結(jié)合到FGFR上的GRB14SH2－突變體的表達(dá)能夠使FGF產(chǎn)生效應(yīng)，這就預(yù)示GRB14與還未被鑒定的下游區(qū)效應(yīng)器能夠相互作用，對(duì)FGFR的催化活性沒(méi)有影響。因此，GRB14對(duì)胰島素的抑制作用機(jī)制和對(duì)FGF在細(xì)胞增生活性上的作用機(jī)制可能不同。

Daly等［15］發(fā)現(xiàn)grb14mRNA在大量的人乳腺和前列腺癌細(xì)胞中被高度表達(dá)。這就可能表明在這個(gè)細(xì)胞系中，GRB14在細(xì)胞增生作用上能起到正向作用。但是還不清楚GRB14蛋白的表達(dá)水平是否被增加，還有它是否是一個(gè)野生型或者是GRB14的突變體。Reilly等［16］發(fā)現(xiàn)GRB14能夠與活化的FGF受體結(jié)合。Edith Browaeys－Poly等［17］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)敲除了grb14基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，與沒(méi)有敲除的相比，F(xiàn)GF誘導(dǎo)的Akt磷酸化被增強(qiáng)了。而且經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GRB14－FGFR復(fù)合物的形成（圖2）。綜合分析這些結(jié)構(gòu)，表明GRB14在FGF信號(hào)途徑上起到非常重要的作用。

圖2 FGFR在活細(xì)胞中與GRB14相互作用（來(lái)自參考文獻(xiàn)［17］）

3 grb14基因的研究進(jìn)展

目前對(duì)grb14基因的研究主要集中于人和小鼠上，在牛上還沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)的報(bào)導(dǎo)。2004年Bertrand Cariou等在綜述中分析了GRB14的結(jié)構(gòu)和功能［14］。2010 年 Edith Browaeys－Poly等［17］經(jīng) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRB14能夠與FGFR相互作用，而纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）是脊椎動(dòng)物發(fā)育和組織生長(zhǎng)和發(fā)育的決定性調(diào)節(jié)器，因此，GRB14可能在脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育上起作用。目前為止，grb14基因的多態(tài)性與牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀的相關(guān)性研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。

4 展望

鑒于目前在小鼠和人上的研究發(fā)現(xiàn)GRB14在胰島素信號(hào)和FGF信號(hào)途徑上具有重要作用。因此，GRB14可能在脊椎動(dòng)物發(fā)育中起著一定的作用，它可能對(duì)肉牛的生長(zhǎng)發(fā)育起到非常重要的影響。所以我們可以把grb14基因作為一個(gè)候選基因，利用SSCP和RFLP等分子遺傳標(biāo)記方法來(lái)研究其在動(dòng)物遺傳育種上的作用［18］。研究grb14基因的突變性對(duì)家畜經(jīng)濟(jì)性狀的影響無(wú)疑具有非常重要的理論和經(jīng)濟(jì)意義，以便為黃牛品種改良和選育工作提供理論依據(jù)。

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