焦炳欣 華文浩 陳志海 李興旺 楊曉玲 何艷群 周 淳 周 茹 郭 杰

首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院，北京 100015

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的危害嚴重的寄生蟲病，我國曾將瘧疾發(fā)病控制在較低水平[1]，2000年以來，瘧疾疫情出現(xiàn)回升，目前防治工作依然十分嚴峻。因此，及時、準確的診斷對有效治療瘧疾及控制其流行具有重要意義[2]。本研究通過對疑似瘧疾患者血樣用鏡檢法、OptiMAL法和實時熒光定量PCR法進行瘧原蟲的檢測，并將快速免疫層析法和實時熒光定量PCR法與傳統(tǒng)鏡檢法做比較，旨在探討瘧原蟲對抗瘧藥體外敏感性監(jiān)測的方法，為指導臨床抗瘧藥的合理使用提供支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

67份血樣來自2010年1月～2012年3月來我院就診的瘧區(qū)發(fā)熱患者。每份血樣分別涂制厚薄血片后留存血樣，-20℃低溫保存。樣本采集均為靜脈取血，2%EDTA-Na2抗凝。

1.2 儀器與試劑

ABI PRISM7300實時熒光定量PCR儀 （美國ABI公司）。瘧原蟲核酸測定試劑盒。惡性、間日瘧、卵形瘧原蟲核酸測定試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。單克隆抗體免疫層析試劑盒（OptiMAL-IT）（瑞士DiaMed生物醫(yī)藥公司）。

1.3 方法

1.3.1 鏡檢方法

每份血樣均涂制厚薄血膜各1張，吉氏染色。高倍鏡下觀察血涂片，并計數(shù)蟲體密度。瘧原蟲的密度＝瘧原蟲數(shù)÷白細胞數(shù)×患者每微升血中白細胞數(shù)。

1.3.2 單克隆抗體免疫層析試劑盒OptiMAL法（以下稱OptiMAL法）

將患者全血點樣到試劑盒的點樣孔上，樣品將沿纖維膜向上移動，如樣品中含有惡性虐乳酸脫氫酶或者其他瘧疾乳酸脫氫酶，將會與特定位置的單克隆抗體結合并發(fā)出顏色，結果的判斷標準為僅在控制線處出現(xiàn)反應帶表明實驗成功且為陰性，在控制線和瘧疾反應帶處同時出現(xiàn)反應為瘧疾陽性。

1.3.3 熒光定量PCR方法

參照瘧原蟲核酸測定試劑盒說明書進行，試劑盒采用聚合酶式反應（PCR）技術結合熒光探針技術，對瘧原蟲特異性核酸片段進行熒光PCR檢測。

1.3.3.1 瘧原蟲DNA提取 全血標本取100 μL（震蕩混勻10 s）分別加入100 μL核酸提取液，震蕩10 s，99℃干浴10 min，13000 r/min離心10 min，保留上清備用。同時將陽性對照品進行10、100、1000倍梯度稀釋，備用。

1.3.3.2 熒光定量PCR檢測 熒光反應管置于定量熒光PCR儀上，循環(huán)參數(shù)設 37℃×2 min；94℃×2 min；再按 93℃×15 s→60℃×60 s，循環(huán)40次；單點熒光檢測在60℃。反應體系為40 μL。上機進行擴增。

1.3.3.3 DNA含量的測定 實驗結束儀器根據(jù)其濃度自動生成標準曲線。循環(huán)閾值（Ct值）與起始模板量呈直線負相關。根據(jù)檢測樣品的Ct值，即能求出起始DNA的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三種不同方法檢出率比較

67例疑似瘧疾來我院就診的患者中，鏡檢檢出瘧原蟲38例 （56.7%）；OptiMAL法檢出瘧原蟲35例 （52.2%），PCR法檢出瘧原蟲42例（62.7%）；經(jīng)卡方檢驗，3種檢測方法定性判斷結果之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.471）。

2.2 臨床特征結合實驗室與PCR技術檢出率比較

在上述瘧疾陽性患者中，經(jīng)臨床特征結合實驗室檢測確診28例為惡性瘧，14例為間日瘧，PCR技術檢出惡性瘧28例，間日瘧14例，符合率為100%。

2.3 三種方法的分析性能評價

以臨床診斷為標準，對檢測瘧原蟲3種方法的分析性能進行評價。見表1。

表1 三種方法的分析性能評價（%）

2.4 OptiMAL法治療效果的考核

28例惡性瘧和14例間日瘧患者經(jīng)常規(guī)治療24 h、3 d、1周后分別采血考核治療效果，治療3 d后部分患者陰轉，但治療1周后所有患者均表現(xiàn)為陰性，表明未出現(xiàn)耐藥株（圖1）。

圖1 瘧疾患者服藥后24 h、3 d和1周用OptiMAL法考核效果

2.5 鏡檢法（蟲體密度/μL）治療效果考核

42例瘧疾患者在治療前，治療后24 h、3 d、1周和2周后瘧原蟲的蟲體密度分別為 6.1×105/μL，9.2×105/μL，100/μL<50/μL（陰性），<50/μL（陰性）。

2.6 PCR法治療效果的考核

監(jiān)測42例瘧疾患者治療前，治療后24 h、3 d、1周和2周后瘧原蟲的核酸含量分別為 2.7×107、2.1×105、4.27×103、2.92×102、33 copies/mL?；颊哐泻怂岷堪殡S病情逐漸好轉呈下降趨勢，可作為停藥的依據(jù)。

3 討論

檢出瘧原蟲是瘧疾明確診斷的最直接證據(jù)。目前最常用的是顯微鏡檢查法，但由于瘧區(qū)人群普遍服用抗瘧藥物而影響了原蟲正常形態(tài)[3]，造成對外周血瘧原蟲有很強的抑制作用；同時低原蟲血癥和混合感染患者的增多使傳統(tǒng)的瘧疾診斷方法不能適應現(xiàn)代瘧疾監(jiān)控的要求，一些對傳統(tǒng)方法的改進及新的診斷技術應運而生。目前瘧疾的監(jiān)測方法包括病原學診斷即顯微鏡厚/薄血片的檢查、免疫學檢查即快速免疫診斷試條和病原基因診斷[4]即實時定量PCR法等。

實驗結果表明，3種方法對瘧疾陽性檢出率無顯著差異，但PCR法敏感性最高。據(jù)文獻報道：PCR檢測的敏感度可達1個原蟲/μL；鏡檢法最低檢出限為3～4個/萬紅細胞，而OptiMAL法最低檢出限為10～20個/L血（含350萬～600萬紅細胞）[5]，在本研究中，當原蟲密度較低（<50/μL）時，即在瘧疾處于較低水平的原蟲血癥時，靠鏡檢法難以查到，容易出現(xiàn)漏診，而用PCR法可彌補這一不足。

實驗結果表明，瘧原蟲3種檢測方法的特異性無明顯差異。但檢測中有兩例鏡檢法為陰性，而OptiMAL法與PCR法檢測結果一致，均為陽性。原因可能是瘧原蟲在藥物治療前，在紅細胞中形態(tài)完整，且有一定的密度，鏡檢法可檢出；一旦藥物治療后，瘧原蟲被裂解、破壞、分解，其形態(tài)遭到破壞，此時用染色鏡檢法很難診斷，而以分子形式存在血液中的乳酸脫氫酶則仍可被檢出，直至血液中的瘧原蟲乳酸脫氫酶被分解代謝。

OptiMAL法的原理是利用乳酸脫氫酶（LDH）單克隆抗體捕獲溶血中的LDH抗原的免疫層析技術[6-7]。由于血液中LDPH與蟲體血癥呈平行相關，同時瘧原蟲乳酸脫氫酶作為原蟲的一種特殊形式的循環(huán)抗原與人紅細胞和其他物質的乳酸脫氫酶具有顯著不同的物理生化特性，易于區(qū)分，可作為瘧原蟲存在的標志物。從表中可知瘧原蟲患者在治療3 d部分患者出現(xiàn)陰轉，但治療1周后所有患者均表現(xiàn)為陰性反應。原因是OptiMAL法可反映藥物治療后原蟲數(shù)量的下降，檢測同種或異種瘧原蟲的重復感染及瘧疾復燃情況，同時由于死亡的瘧疾不能分泌LDH[8-9]，因此能夠考核治療效果和鑒定抗藥株的出現(xiàn)。但由于是定性實驗，不能作為停藥的依據(jù)。

定量PCR的優(yōu)勢在于解決了對瘧原蟲密度的快速簡便和準確的獲取，量化相同蟲種不同基因型混合感染的情況，動態(tài)觀察疾病發(fā)展狀況。從表1中可知，隨著治療天數(shù)的增加，患者DNA拷貝數(shù)逐漸減少，兩周后PCR法轉陰，可作為停藥的依據(jù)。

本研究表明，OptiMAL法和PCR法作為鏡檢法的補充，OptiMAL法中LDPH具有很好的特異性，在瘧疾得到治療后，其PLDH能快速從血液中清除，從而避免因循環(huán)抗原長期存在所造成的假陽性而導致濫用藥物，考核治療效果，更適應大規(guī)模流行區(qū)域的需要，PCR法在低原蟲血癥、蟲體的鑒別和是否繼續(xù)用藥方面具有非常重要的實用價值。

[1]劉燕，湯林華.檢測和鑒定瘧原蟲蟲種PCR方法的比較[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志，2008，35（1）：17-21.

[2]Cui J，Wang ZQ，Zhang D.Studies on Specific Diagnostic Antigens in Excretory-secretory Products from Trichinella spiralis Muscle Larvae[J].Chin J Parasitol Dis，2003，21（5）：268-271.

[3]江莉，王真瑜.多重PCR種特異性檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲方法的建立[J].國際醫(yī)學寄生蟲雜志，2009，36（2）：78-81.

[4]劉德全，馮曉平，楊恒林，等.我國惡性瘧原蟲對氯喹抗性的消長[J].中國寄生蟲學與寄生蟲雜志，2005，23（1）：27-31.

[5]Bzik DJ，F(xiàn)ox BA，Gonyer K.Expression of plasmodium falcipanim lactate dehynogenase in excherichiacoli.Biochem parasxi-tol [J].Mol Biochem Parasitol，1993，59：155-156.

[6]Palmer CJ，Lind JF，Klaskala WI，et al.Evaluation of the optimal test forrapid diagnosis of plasmodium vivax and plasmodium falciparum malaria[J].Clin Microbiol，1998，36：203-206.

[7]CookeAH，ChiodiniPL，DohertyT，et al.Comparison of a parasite Lactate denydrogenase-based immunochromatographic antigen Detection assay （OptiMAL） with microscopy for detection of malaria parasites in human blood sampies[J].Am J Trop medHyg，1999，60：173-176.

[8]Moody AH，Chiodini PL.Non-microscopic method for malaria diagnosis us-ing OptiMAL-IT，a second-generation dipstick for malaria pLDH antigen detection[J].Science，2002，59：228-231.

[9]張再興，楊亞明.ICT瘧疾快速診斷卡與鏡檢的現(xiàn)場應用效果比較[J].實用寄生蟲病雜志，2000，8（1）：29-30.