王 俏 朱 虹 沈 策▲

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200233；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科，上海 200011

膿毒癥是一種感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，肺是常累及的靶器官，常并發(fā)急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）[1]。 其中，ALI的發(fā)病急，死亡率高，是危重病治療的難點(diǎn)之一。烏司他?。║linastatin，UTI）是從健康成年男性尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑[2]。研究表明，UTI除對(duì)多種蛋白酶、糖脂水解酶具有抑制作用外，還具有抑制多種炎癥介質(zhì)釋放等作用。基礎(chǔ)及臨床初步研究提示，UTI具有減輕肺損傷，緩解呼吸衰竭等作用，但是其具體作用機(jī)制仍不明確。熱休克蛋白（HSP）是一類細(xì)胞在受熱、生物應(yīng)激、理化因素等刺激后產(chǎn)生的在進(jìn)化上高度保守的伴隨細(xì)胞蛋白，可以增強(qiáng)細(xì)胞的應(yīng)激能力，保護(hù)細(xì)胞損傷的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察UTI對(duì)膿毒癥ALI大鼠肺組織HSP70表達(dá)的影響，研究UTI對(duì)膿毒癥ALI大鼠的肺保護(hù)作用，探討可能的作用機(jī)制，為臨床膿毒癥肺損傷的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠39只，體重200～250 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

烏司他?。║linastatin，UTI）50000 U/支，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制備與分組 39只Wistar大鼠，分為3組：假手術(shù)（sham）組 9 只，ALI組 15 只，烏司他?。║TI）組 15只。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4]的方法，以大鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）復(fù)制膿毒癥模型。以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定，腹正中切開1.5 cm長(zhǎng)的切口，在盲腸根部結(jié)扎，用18號(hào)針在游離端穿通2次，輕擠出少量腸內(nèi)容物，留置2 cm皮瓣防止針孔閉合，送回盲腸于腹腔，縫合切口，術(shù)畢皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。UTI組于造模前30 min腹腔注射UTI（20000 U/kg），ALI組于造模前30 min腹腔注射生理鹽水2 mL。在假手術(shù)后6、12、24 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)sham組分別處死大鼠3只，ALI組和UTI組分別處死大鼠5只。

1.3.2 標(biāo)本的制備 分別于各時(shí)間點(diǎn)取抗凝腹主動(dòng)脈血0.5 mL，行動(dòng)脈血?dú)夥治?，測(cè)定大鼠動(dòng)脈血氧分壓（PaO2），取每只大鼠左肺上葉測(cè)定肺組織濕/干重比值（W/D），取右下肺組織置于-80℃保存，用于測(cè)定肺組織中的HSP70 mRNA含量。另取左肺下葉置于10%中性甲醛溶液中固定，制成病理切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime-PCR）檢測(cè)肺組織HSP70 mRNA含量 取肺組織50 mg，按Trizol法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增（Stratagene M×3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀）。HSP70引物序列：上游 5′-GCA CCA GCA GCC ATC AAG AGT-3′，下游 5′-GTG TGC AAG CCG ATC ATC AGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 180 bp。 HSP70 實(shí)時(shí) PCR 條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共32個(gè)循環(huán)。所有待檢標(biāo)本每組設(shè)3個(gè)平行孔，各重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)化HSP70基因的表達(dá)量為各標(biāo)本HSP70基因CT值與相應(yīng)內(nèi)參基因β-actin CT值的差值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0軟件包分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。 以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)脈血?dú)夥治鲎兓?/h3>

ALI組大鼠動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）隨CLP術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，與sham組比較，顯著降低（P<0.05），UTI組PaO2各時(shí)間點(diǎn)較ALI組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鯬aO2結(jié)果比較（mm Hg，）

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治鯬aO2結(jié)果比較（mm Hg，）

注：與sham組比較，*P<0.05；與ALI組比較，#P<0.05

組別 只數(shù) 術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h sham組ALI組UTI組35596.3±2.0579.8±3.18*86.5±2.34*#91.5±3.2872.3±4.02*81.0±3.31*#93.7±2.4361.3±3.19*76.5±2.27*#

2.2 肺組織濕/干重比值（W/D）比值變化

ALI組大鼠W/D比值隨CLP術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，較sham組顯著升高（P<0.01），UTI組治療后W/D比值明顯低于ALI組同時(shí)間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織濕/干重（W/D）比值比較（）

表2 各組大鼠肺組織濕/干重（W/D）比值比較（）

注：與sham組比較，*P<0.05；與ALI組比較，#P<0.05

組別 只數(shù) 術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h sham組ALI組UTI組3554.037±0.0605.788±0.180*4.668±0.240*#4.138±0.2506.663±0.230*5.312±0.310*#4.241±0.4307.330±0.320*6.492±0.280*#

2.3 肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化

sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺間質(zhì)無(wú)水腫、無(wú)炎癥，且各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異。ALI組大鼠造模后6 h可見肺泡內(nèi)水腫滲出，伴有出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)病變程度加重，至造模后24 h可見肺泡隔增寬，肺泡內(nèi)嚴(yán)重的充血、出血及肺間質(zhì)見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。UTI組大鼠肺組織病理變化較ALI組輕，造模后6 h可見部分肺泡內(nèi)少量水腫滲出伴有少量出血，至造模后24 h可見大鼠肺泡隔略有增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

2.4 肺組織HSP70 mRNA的表達(dá)

ALI組大鼠肺組織HSP70 mRNA的表達(dá)水平隨著CLP術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高（P<0.05），至CLP術(shù)后12 h達(dá)到高峰。UTI組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織HSP70 mRNA的表達(dá)水平又顯著高于ALI組（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織中HSP70 mRNA表達(dá)相對(duì)密度值比較（）

表3 各組大鼠肺組織中HSP70 mRNA表達(dá)相對(duì)密度值比較（）

注：與sham組比較，*P<0.05；與ALI組比較，#P<0.05

組別 只數(shù) 術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后24 h sham組ALI組UTI組3550.623±0.0300.827±0.090*1.015±0.040*#0.582±0.0501.316±0.150*1.623±0.030*#0.533±0.1401.142±0.040*1.431±0.090*#

3 討論

膿毒癥常見的并發(fā)癥為ALI，其病理特征是肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，表現(xiàn)為廣泛的肺水腫和微小肺不張，臨床上表現(xiàn)低氧血癥[5]。本實(shí)驗(yàn)采用較經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）制作大鼠膿毒癥性ALI模型。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ALI組大鼠動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降明顯，W/D比值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。同時(shí)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ALI組大鼠造模后6 h可見肺泡內(nèi)水腫滲出，伴有出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)病變程度加重，至造模后24 h可見肺泡隔增寬，肺泡內(nèi)嚴(yán)重的充血、出血及肺間質(zhì)見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

HSP是一具有多個(gè)成員的蛋白質(zhì)家族，根據(jù)分子量的大小可以分為多個(gè)亞家族，其主要功能與蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。在各種應(yīng)激反應(yīng)中防止蛋白質(zhì)變性、聚集，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。其中HSP70與肺臟生物學(xué)關(guān)系較為密切，是HSP中最保守的一族，在細(xì)胞應(yīng)激后生成最為顯著，提高機(jī)體組織對(duì)各種應(yīng)激損傷的耐受性。HSP70主要是作為分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，清除細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白質(zhì)，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠進(jìn)行呼吸機(jī)正壓通氣導(dǎo)致機(jī)械張力可誘導(dǎo)肺組織HSP70的表達(dá)增加，改善肺損傷[7]。將載有HSP70的腺病毒基因注入動(dòng)物體內(nèi)可緩解ARDS的進(jìn)展[8]。HSP70可能通過多種機(jī)制防止肺損傷的發(fā)生和發(fā)展：①抗炎癥，使炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生減少，抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加；②抗氧化，可抑制氧陰離子的生成，直接或間接地促進(jìn)釋放自身的抗氧化酶，提高抗氧化酶類的活性；③調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的修復(fù)與合成，減輕應(yīng)激或損傷刺激引起的細(xì)胞膜蛋白的變性，保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)rRNA及DNA的合成途徑免受損傷；④抗細(xì)胞凋亡，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALI組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織HSP70 mRNA表達(dá)水平較sham組顯著升高，至CLP術(shù)后12 h達(dá)到高峰，后開始下降。

UTI是一種廣譜的蛋白水解酶抑制劑，對(duì)多種蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用，具有抑制過度的炎癥反應(yīng)、改善休克時(shí)組織循環(huán)與器官灌注、對(duì)溶酶體酶具有穩(wěn)定作用。UTI在過度炎癥反應(yīng)、缺血和缺氧等造成的心、肺、肝、腎等組織細(xì)胞損害中具有保護(hù)作用。有研究表明，UTI可作用于ALI的早期環(huán)節(jié)，在轉(zhuǎn)錄水平通過P38MARK信號(hào)通路抑制TNF-α，改善促炎性介質(zhì)/抗炎性介質(zhì)失衡狀態(tài)，減輕LPS誘導(dǎo)的ALI[11]。另外，UTI可以抑制肺泡內(nèi)皮細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的分解，減小肺毛細(xì)血管的通透性[12]。臨床上運(yùn)用UTI治療ALI/ARDS綜合征患者，可以改善患者通氣功能，減輕肺水腫，顯著緩解患者的缺氧狀態(tài)，減少多臟器功能衰竭的發(fā)生[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用UTI治療后，UTI組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PaO2較ALI組上升，增高的W/D比值下降，HSP70 mRNA表達(dá)顯著增加，同時(shí)肺組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)均有明顯改善。提示UTI可能通過上調(diào)HSP70的表達(dá)，改善膿毒癥大鼠肺組織的損傷。

綜上所述，運(yùn)用UTI治療膿毒癥ALI后可能通過損傷保護(hù)因子HSP70表達(dá)的上調(diào)，從而減輕了肺組織病理?yè)p傷，對(duì)ALI有保護(hù)作用。這可能是UTI治療膿毒癥ALI有效的機(jī)制之一，但其確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)研究。

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