唐秀麗，付衛(wèi)東 ，張國良，張衍雷，譚萬忠

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081;2.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院外來入侵生物研究中心，重慶北碚 400716)

黃頂菊Flaveria bidentis(L.)Kuntze是一種外來入侵植物。2001年首次在我國衡水湖發(fā)現(xiàn)，后相繼出現(xiàn)在河北邢臺(tái)、廊坊和天津等地，局部已經(jīng)形成了黃頂菊種群［1－2］，對我國生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害［3－4］。黃頂菊是一年生草本，原產(chǎn)于南美洲［5－6］，屬菊科(Asteraceae)堆心菊族(Helenieae)黃頂菊屬(Flaveria)［3］。黃頂菊對農(nóng)作物尤其是玉米田的危害尤為嚴(yán)重，在玉米整個(gè)生長期，黃頂菊均可危害［7］。國內(nèi)外對黃頂菊的研究主要以生物學(xué)特性方面居多［4，8，9，10］。近年來，關(guān)于黃頂菊化感作用方面的研究也越來越多，植物化感作用是自然界普遍存在的一種現(xiàn)象，是植物生存的重要機(jī)制，也是外來植物入侵的一種重要機(jī)制［11，12］。已相繼有黃頂菊水提液對綠豆種子［13］、小麥種子［14］、玉米種子［15］、油菜及油麥種子［16］等發(fā)芽指數(shù)方面［17，18］的報(bào)道。但是，關(guān)于黃頂菊對受體植物生理生化的影響報(bào)道少之又少，而對幼苗根尖的顯微形態(tài)特征方面目前還沒有報(bào)道。本試驗(yàn)以玉米為受體，探討黃頂菊對玉米的化感效應(yīng)，為揭示黃頂菊對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害機(jī)制及抑制其蔓延有著重要意義，從而為綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃頂菊及其根際土壤采自河北省滄州市獻(xiàn)縣陌南村(E:115.62°，N:38.46°)，該地區(qū)是黃頂菊在河北的重度發(fā)生地，黃頂菊已經(jīng)定植并且形成單一群落。

供試受體玉米(Maize L.，紀(jì)元1號(hào))，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃頂菊水提液制備取新鮮黃頂菊地上部分植株100 g，稍除枯枝黃葉后，整株用蒸餾水1000 mL于室溫下浸泡36 h，后經(jīng)4層定性濾紙抽濾得水提液，再將水提液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，以此為母液(0.1 gDW/mL)，稀釋成濃度為0.05 gDW/mL和0.01 gDW/mL，以供生物活性測定試驗(yàn)，后置入冰箱內(nèi)4 ℃ 保存［19］。

1.2.2 玉米幼苗的準(zhǔn)備 選取飽滿度和大小基本一致的玉米種子，用0.5%H2O2處理5 min，后用蒸餾水反復(fù)清洗，置于恒溫水浴鍋內(nèi)30℃催芽3 d(每天換新鮮水1次)。玉米幼苗培育采用沙培加營養(yǎng)液法，所以石英細(xì)沙于10%鹽酸浸泡24 h后反復(fù)沖洗至pH 7.0左右，再用160℃烘干滅菌以供使用。營養(yǎng)液采用1/4強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液［20］，PH調(diào)至5.8。在白瓷盆內(nèi)播入已催芽且芽長基本一致的玉米種子，于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件12 h/12 h，30℃/25℃)，7 d后幼苗供試驗(yàn)使用。

表1 1/4強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液配方Table 1 Prescription of the 1/4 strength Hoagland

1.2.3 對玉米幼苗的處理 將50 mL 三種不同濃度(0.1 gDW/mL、0.05 gDW/mL、0.01 gDW/mL)黃頂菊水提液中，分別加入50 mL1/4強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液，后于振蕩器上混勻3 min，移入培育后的玉米幼苗，每個(gè)白瓷盆中5株，置于溫室中。無菌水為對照。分別處理后第4 d、第8 d、第12 d和第16 d取樣，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)共進(jìn)行了三次重復(fù)。記錄各盆中玉米株高，每盆隨機(jī)選擇玉米葉片0.5 g進(jìn)行可溶性蛋白［21］、可溶性糖類［21］、脯氨酸［22］含量的測定。

1.2.4 幼苗根尖顯微形態(tài)觀察 選取最高濃度0.1 gDW/mL黃頂菊處理以及對照處理中玉米幼苗根尖生長點(diǎn)部位分別用生理鹽水沖洗3次，每次5 min，再用3%戊二醛固定液24 h后，依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇系列脫水(每一梯度脫水20 min)，最后100%的乙醇脫水兩次，后乙酸異戊酷置換，再用CO2臨界點(diǎn)干燥，粘于銅片噴金度膜，最后再用掃描電鏡(日立S－4800)下觀察并照相［23－25］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel2003對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析，組內(nèi)多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法，計(jì)算值并作顯著性檢驗(yàn)，所有圖標(biāo)數(shù)據(jù)表示均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±S.D.)。

2 結(jié)果分析

2.1 黃頂菊水提液對玉米幼苗葉片可溶性蛋白的影響

不同濃度黃頂菊水提液處理玉米幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量產(chǎn)生了一定的影響(圖1)，方差分析結(jié)果表明不同濃度和不同處理時(shí)間后幼苗葉片的可溶性蛋白含量出現(xiàn)極顯著性差異(F3，48=1365，P=0.0001;F3，48=460.913，P=0.0001)。且不同化感物質(zhì)濃度和不同處理時(shí)間之間存在極顯著的交互作用(F9，48=36.426，P=0.0001)，即不同濃度黃頂菊水提液對可溶性蛋白含量的影響隨著處理時(shí)間的變化而異。自處理后第4 d開始，玉米幼苗葉片可溶性蛋白含量和對照中相比出現(xiàn)顯著的活性差異，對照中可溶性蛋白含量由 1.14 μg/g·FW 增加到 5.58 μg/g·FW。兩個(gè)高濃度(0.05 gDW/mL 和 0.1 gDW/mL)處理后，含量分別由 0.38 μg/g·FW 增加到 0.59 μg/g·FW，0.09 μg/g·FW 增加到 0.42 μg/g·FW。和對照相比增幅不大。組內(nèi)多重比較表明，玉米幼苗葉片可溶性蛋白含量隨著處理濃度增加而逐漸增加，隨著處理時(shí)間的延長而逐漸減少。

圖1 黃頂菊水提液對玉米幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Impacts of F.bidentis aqueous extracts on contents of soluble protein in leaves of maize seedlings

2.2 黃頂菊水提液對玉米幼苗葉片可溶性糖類的影響

不同濃度黃頂菊水提液處理對玉米幼苗體內(nèi)可溶性糖含量產(chǎn)生了一定的影響(圖2)，方差分析結(jié)果表明不同濃度和不同處理時(shí)間后幼苗葉片的可溶性糖含量出現(xiàn)極顯著性差異(F3，48=30580，P=0.0001;F3，48=5415，P=0.0001)。且不同化感物質(zhì)濃度和不同處理時(shí)間之間存在極顯著的交互作用(F9，48=3296，P=0.0001)，即不同濃度黃頂菊水提液對可溶性糖含量的影響隨著處理時(shí)間的變化而異。自處理第4 d開始，對照中可溶性糖類含量變化不大，由20.18 μmol/g變化為22.08 μmol/g，增幅僅為9.4%。最低濃度0.01 gDW/mL和最高濃度0.1 gDW/mL處理后，增幅分別達(dá)到45.9%和43.3%。組內(nèi)多重比較表明，玉米幼苗葉片可溶性糖含量隨著處理濃度增加和處理時(shí)間的延長而逐漸增加。

2.3 黃頂菊水提液對玉米幼苗脯氨酸含量的影響

不同濃度黃頂菊水提液處理后對玉米幼苗體內(nèi)脯氨酸含量產(chǎn)生了一定的影響(圖3)，方差分析結(jié)果表明不同濃度和不同處理時(shí)間后幼苗葉片的脯氨酸含量出現(xiàn)極顯著性差異(F3，48=9119，P=0.0001;F3，48=518.916，P=0.0001)。且不同化感物質(zhì)濃度和不同處理時(shí)間之間存在極顯著的交互作用(F9，48=68.92，P=0.0001)，即不同濃度黃頂菊水提液對脯氨酸的影響隨著處理時(shí)間的變化而異。兩個(gè)最高濃度處理后第4 d到第12 d，脯氨酸含量分別增幅25.5%和37.0%，相對于對照中脯氨酸含量增幅9%，變化明顯。組內(nèi)多重比較表明，玉米幼苗葉片脯氨酸含量隨著處理濃度增加和處理時(shí)間的延長而逐漸增加。

2.4 幼苗根尖顯微結(jié)構(gòu)

經(jīng)最高濃度(0.1gDW/mL)黃頂菊水提液處理后，和對照相比，根尖表皮細(xì)發(fā)生了明顯的變化。高濃度處理下表皮脫落細(xì)胞很多，根冠頂部細(xì)胞干癟，部分脫落，尤其在頂部表層細(xì)胞，很多僅剩下空的細(xì)胞腔。內(nèi)層細(xì)胞已經(jīng)基本暴露出來，根冠頂部細(xì)胞大部分破裂。在×500倍的結(jié)果中可見，對照的根尖細(xì)胞排列規(guī)則且細(xì)胞成長圓形，形態(tài)明顯，細(xì)胞比較扁平且飽滿。被化感物質(zhì)處理后，幼苗根尖細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂，明顯膨脹，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)明顯淡稀，空殼細(xì)胞。

3 結(jié)果與討論

河北農(nóng)大研究，黃頂菊對玉米脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量減少［26］。生長在逆境環(huán)境中的植物其代謝反映變化趨勢相同，即水解作用增強(qiáng)，合成作用減弱。由本研究結(jié)果可知，隨著黃頂菊水浸提液質(zhì)量濃度的增加，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，這可能是因?yàn)樯L在含有黃頂菊環(huán)境中的玉米幼苗的生長受到抑制，其體內(nèi)的水解作用增強(qiáng)，將可溶性蛋白降解為氨基酸。這種代謝失調(diào)最終產(chǎn)生植物的傷害作用。這與黃花蒿對小麥幼苗的化感作用一樣［27］。

圖4 黃頂菊水提液處理后玉米幼苗根尖細(xì)胞的變化Fig.4 Celluar changes of upland maize seedling roots treated with extracting liquor from F.bidentis

可溶性糖是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，逆境脅迫條件下，作為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性糖含量的增加可以增加植物體內(nèi)的滲透勢，以利于植物體在逆境中維持體內(nèi)正常的所需水分，提高植物的抗逆性［28］。實(shí)驗(yàn)表明黃頂菊植株水提液處理下玉米葉片中可溶性糖含量增加?？扇苄蕴呛康脑黾右环矫婺苡行岣呷~片細(xì)胞的滲透勢，增強(qiáng)玉米幼苗對逆境脅迫的耐受性;另一方面，可溶性糖在玉米體內(nèi)的積累，減少了糖類物質(zhì)向其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)變，從而阻礙了玉米幼苗的正常生長。類似與黃頂菊水提液對小麥幼苗的化感作用影響［29］，但是與芒其對玉米幼苗中可溶性糖類的影響有一些不同［30］。

脯氨酸(Pro)是植物在逆境脅迫下體內(nèi)積累的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一［31］。正常情況下，植物體內(nèi)的Pro含量較低，脅迫時(shí)含量便會(huì)大大增高，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此Pro可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生理生化指標(biāo)［32］。通過本試驗(yàn)可知，不同濃度黃頂菊水提液脅迫下玉米幼苗，Pro含量差異均達(dá)極顯著。且Pro含量隨著黃頂菊水提液濃度的升高而升高，不同濃度處理時(shí)均比對照中脯氨酸含量要高。這與關(guān)于SO2對玉米幼苗中Pro影響趨勢一樣［33］。在黃頂菊水提液濃度為0.01 gDW/mL條件下，玉米幼苗葉片的脯氨酸含量的變化不大，說明玉米具有一定的耐受性。當(dāng)濃度達(dá)到0.05 gDW/mL和0.1 gDW/mL條件下，脯氨酸含量急劇增加。而在后期，脯氨酸增加量幅度不大，處理中黃頂菊對玉米幼苗的抑制作用已經(jīng)使得玉米不能正常生長。黃頂菊水提液處理下玉米葉片脯氨酸含量的增加有兩種可能，一方面是黃頂菊水提液阻斷了玉米幼苗根部游離氨基酸向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，使游離脯氨酸含量增加;二是黃頂菊水提液能增加蛋白質(zhì)的降解速度，加快游離脯氨酸的積累。這說明黃頂菊水提液對玉米的生長有較強(qiáng)的抑制作用，但黃頂菊水提液對游離脯氨酸含量增加的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

根系是作物直接感受外界水分信號(hào)并吸收水分的器官，與作物抗逆性形成密切相關(guān)。關(guān)于紫羊茅(Festuca rubra L.)對水芹(Oenanthe stolonifera(Roxb)Wall)和一種蟹草(Lygodium japonicum(T.)S.)的化感作用研究，發(fā)現(xiàn)其化感分泌部位在須根尖的局部細(xì)胞中［34］。黃頂菊水提液對玉米幼苗的化感作用，同樣體現(xiàn)在對幼苗根長的生長狀況上，類似于黃花蒿對小麥幼苗的影響［27］。根尖細(xì)胞的外觀和解剖結(jié)果表明，玉米幼苗的根系生長和發(fā)育已嚴(yán)重受到抑制和干擾，主要表現(xiàn)在幼苗根尖細(xì)胞形態(tài)和大小的變化。應(yīng)用掃描電鏡研究紫莖澤蘭水提液對玉米根的形態(tài)影響，結(jié)果顯示處理后的玉米根尖生長受到嚴(yán)重干擾，根尖表皮出現(xiàn)明顯脫落甚至腐爛，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致［35］。

化感物質(zhì)作為一種信息載體物質(zhì)幾乎存在于植物的所有器官中。對黃頂菊化感作用的研究，本實(shí)驗(yàn)選用受體植物內(nèi)最直接明確的生理指標(biāo)和形態(tài)指標(biāo)，從而為后續(xù)探究黃頂菊化感作用機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

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