付衛(wèi)民 ，王淑芬 ，王秀峰 ，何啟偉 ，劉賢嫻 ，韓曉雨

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，泰安，271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家蔬菜改良中心山東分中心）

蘿卜 （Raphanus sativusL.var.longgpinnatus Bailey）為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，起源于我國(guó)，目前在世界各地廣泛栽培，是主要的蔬菜作物之一。近年來(lái)，隨著蘿卜育種工作的不斷進(jìn)步和蘿卜種質(zhì)資源深入挖掘利用，使得蘿卜種質(zhì)資源日益豐富，但同時(shí)也對(duì)蘿卜的遺傳多樣性鑒定、新品種測(cè)試與保護(hù)工作提出了新的挑戰(zhàn)。

基于DNA多態(tài)性分析的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為遺傳多樣性鑒定與評(píng)價(jià)的通用方法。隨機(jī)序列擴(kuò)增多態(tài)性 （RAPD）、限制性片段擴(kuò)增多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）等是植物遺傳多樣性研究中運(yùn)用最多的幾種方法[1]。而近幾年新興的ESTSSR標(biāo)記技術(shù)除具有SSR標(biāo)記多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)外，還很好地彌補(bǔ)了其缺點(diǎn)，例如操作簡(jiǎn)單，引物獲取比較容易，可以直接根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列篩選SSR，設(shè)計(jì)引物等。EST-SSR標(biāo)記能更準(zhǔn)確地反映出不同基因型之間的遺傳差異和親緣關(guān)系[2]，且引物的通用性更好[3]，另外，由于EST序列直接位于基因的編碼區(qū)，因此更容易篩選到與功能基因緊密連鎖的標(biāo)記。目前該方法已廣泛應(yīng)用于小麥、大豆、黃瓜、辣椒、油菜、番茄等作物的分子標(biāo)記研究[4～9]。但鑒于該方法基于PCR技術(shù)，反應(yīng)條件易受多種因素影響，因此，有必要對(duì)實(shí)際研究中相應(yīng)的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以提高研究效率和獲得更為準(zhǔn)確的研究結(jié)果。

本研究對(duì)較為常用的20 μL PCR技術(shù)體系，利用 L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從模板 DNA、Mg2+、dNTP、引物、Taq酶等5個(gè)因素4種水平對(duì)蘿卜EST-SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化分析，以期建立一套適合蘿卜的EST-SSR反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用蘿卜品種為紫玉。快捷型植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司；Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶均購(gòu)自寶生物工程 （大連）有限公司；引物合成于北京六合華大基因科技股份有限公司，其他常規(guī)試劑均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；50 bp maker購(gòu)自Fermentas公司。

1.2 試驗(yàn)方法

①DNA的提取 在蘿卜苗期，取上數(shù)第3～4片葉100 mg，洗凈，加入適量液氮充分研磨，采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。

②PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增在ABI2720PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。FWM11為優(yōu)化引物，其他10對(duì)為驗(yàn)證引物（表1）。

③正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究設(shè)計(jì)為DNA模板濃度、Mg2+、dNTPs、引物濃度和TaqDNA聚合酶濃度5個(gè)因素 4 個(gè)水平的 L16（45）正交試驗(yàn)（表 2），另外每管加 2 μL 不含 Mg2+的 10×PCR Buffer。 擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)，銀染顯色，照相保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA濃度和純度檢測(cè)

供試材料的基因組DNA，紫外分光光度檢測(cè)A260/A280值均在1.8～2.0；0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1）顯示，條帶清晰，無(wú)降解，純度高，達(dá)到EST-SSR分析的要求。

2.2 正交優(yōu)化結(jié)果分析

PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果表明（圖2），3、11和14擴(kuò)增條帶清晰，14號(hào)反應(yīng)體系條帶最濃，試劑使用最經(jīng)濟(jì)，因此確定最佳體系為DNA模板65 ng/20 μL，Mg2+0.8 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA 酶0.4 U/20 μL，每個(gè)引物 0.8 μmol/L。

2.3 優(yōu)化體系的驗(yàn)證

本試驗(yàn)采用紫玉蘿卜F2代綠葉植株構(gòu)建的基因池和11對(duì)引物對(duì)14號(hào)反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證，F(xiàn)2基因組DNA為對(duì)照。結(jié)果表明（圖3），10對(duì)引物擴(kuò)增條帶符合預(yù)期片段大小，條帶清晰，均為有效擴(kuò)增。

3 小結(jié)與討論

由上述擴(kuò)增結(jié)果表明，DNA模板在4個(gè)水平范圍都有效擴(kuò)增，對(duì)反應(yīng)體系影響最??；引物、TaqDNA酶和dNTPs在3個(gè)水平內(nèi)有效擴(kuò)增，對(duì)反應(yīng)體系影響也不大；Mg2+濃度為0.8 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶特異性好，條帶清晰，均為預(yù)擴(kuò)增條帶，且Mg2+對(duì)擴(kuò)增效率也有影響，濃度過(guò)高或過(guò)低均使非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物減少或?qū)е聰U(kuò)增反應(yīng)失敗，故Mg2+對(duì)該反應(yīng)體系影響最大。本研究結(jié)果與王娟等[10]優(yōu)化蘋果ESTSSR標(biāo)記PCR反應(yīng)最佳體系、韓明利等[9]優(yōu)化番茄EST-SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)體系、李紅雙等[11]優(yōu)化蘿卜SRAP-PCR反應(yīng)體系中的關(guān)鍵Mg2+因素相一致。而與佟海申等[12]研究大白菜EST-SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)體系4因素（不包括Mg2+）的最佳反應(yīng)濃度和關(guān)鍵影響因素有差異，原因可能是沒(méi)有單獨(dú)對(duì)Mg2+因素考慮和試驗(yàn)材料不同所致。

本研究利用正交試驗(yàn)優(yōu)化蘿卜EST-SSR標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系，具有擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，為蘿卜種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)、EST-SSR分子標(biāo)記輔助選擇育種等奠定了十分重要的基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

表1 PCR反應(yīng)體系引物

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45）

圖1 基因組DNA電泳結(jié)果

圖2 正交設(shè)計(jì)EST-SSR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果

圖3 14號(hào)反應(yīng)體系在F2中的驗(yàn)證

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