王鮮萍,魯紹雄

（1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南開封475001；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,云南昆明650201）

BC1設(shè)計下標(biāo)記密度對QTL定位精確性的影響

王鮮萍1,魯紹雄2

（1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南開封475001；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,云南昆明650201）

通過計算機模擬分析BC1設(shè)計中標(biāo)記密度（標(biāo)記間隔分別為5、10、20、50 cM）對數(shù)量性狀基因座（QTL）定位精確性的影響,以均方誤（MSE）為衡量指標(biāo).結(jié)果表明：當(dāng)遺傳圖譜上相鄰標(biāo)記間的圖距在5 cM以上時,提高標(biāo)記密度,對于提高QTL定位的準(zhǔn)確性和精確性具有積極的效應(yīng),但當(dāng)標(biāo)記密度達(dá)到某一程度（相鄰標(biāo)記間圖距為2 cM）時,由于方法本身的局限,繼續(xù)增加標(biāo)記密度,對標(biāo)記-QTL連鎖分析法定位QTL的效果則沒有實際意義,標(biāo)記密度對檢驗統(tǒng)計量LOD值的影響不明顯.

BC1設(shè)計；標(biāo)記密度；QTL定位；最大似然法

家畜的大多數(shù)重要經(jīng)濟(jì)性狀都是具有復(fù)雜遺傳基礎(chǔ)的數(shù)量性狀（quantitative trait）.傳統(tǒng)數(shù)量遺傳學(xué)的一系列理論和方法都是建立在微效多基因假說（minor-effect polygene hypothesis）的基礎(chǔ)上,該假說認(rèn)為數(shù)量性狀是受大量的、效應(yīng)微小而類似、并且可加的基因控制.這些基因在世代相傳中服從孟德爾定律,即分離規(guī)律和自由組合規(guī)律,以及摩爾根的連鎖互換規(guī)律.由于單個基因的效應(yīng)很小,易受環(huán)境影響,因而無法確定單個基因的效應(yīng)及其在染色體上的位置[1-2],更不能對其進(jìn)行準(zhǔn)確的識別、分離和克隆.但在近二、三十年來,大量的理論研究和試驗結(jié)果表明,數(shù)量性狀既受數(shù)目較多的微效基因（minor-effect gene）的影響,還受一個或少數(shù)幾個起主導(dǎo)作用的主效基因（major gene）的影響,即是一種主基因+多基因的混合遺傳（mixed inheritance）模式[3-4].隨著分子遺傳學(xué)理論和方法的迅速發(fā)展,大量的分子遺傳標(biāo)記被發(fā)現(xiàn),利用這種分子標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜,我們可以對各個數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus,QTL）的作用和在染色體上的位置進(jìn)行研究.近年來,人們在利用分子標(biāo)記連鎖圖譜進(jìn)行QTL的檢測和定位方面做了大量的工作,并利用實際資料進(jìn)行分析,相繼檢測出了一些可能有較大作用的QTL.但一個突出的問題就是QTL的精確定位.一般說來,檢測QTL是否存在比較容易,但要確定QTL在染色體上所處的精確位置就比較困難,而且QTL的效應(yīng)很難精確估計.QTL精確定位對標(biāo)記輔助選擇、QTL克隆等研究工作都是非常重要的.影響QTL定位精確性的因素主要有：群體規(guī)模、性狀遺傳力、QTL在染色體上的位置、標(biāo)記密度.其中,QTL的位置和性狀遺傳力對于特定的性狀和群體是相對固定的,而標(biāo)記密度和資源群體規(guī)模在一定程度上是可以人為控制的.理論研究表明,QTL定位隨著標(biāo)記密度的增加而升高,但實際研究表明,當(dāng)標(biāo)記密度增加到一定水平時,QTL定位的精確性反而下降.因此,標(biāo)記密度的大小直接影響到QTL定位的精確性.本文在群體規(guī)模、性狀遺傳力、QTL位置固定情況下通過計算機模擬方法研究BC1設(shè)計下標(biāo)記密度對QTL定位精確性的影響,以期找出一個最佳的標(biāo)記密度.

1 材料與方法

假定某一常染色體的總長度為100 cM,在該染色體上存在著一個影響目標(biāo)數(shù)量性狀的QTL.連鎖圖譜上的標(biāo)記呈均勻分布,即相鄰標(biāo)記間的圖距是相等的.每個標(biāo)記座位只有2個等位基因,且都為共顯性標(biāo)記.QTL有兩個等位基因,且不存在顯性效應(yīng).QTL定位采用的資源群體為BC1設(shè)計,并采用最大似然分析法進(jìn)行QTL的檢測與定位.

1.1 數(shù)據(jù)模擬

1.1.1 F0代標(biāo)記與QTL基因型的模擬假定F0世代中兩個親本群體P1和P2的標(biāo)記座位和QTL均處于連鎖平衡（linkage equilibrium）狀態(tài),每一標(biāo)記和QTL座位均只有2個等位基因,且在每一座位上均為相應(yīng)的純合子.每一個體的標(biāo)記座位和QTL的等位基因利用（0,1）均勻分布隨機數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生隨機數(shù)序列來確定,并進(jìn)而確定每一個座位的基因型.

1.1.2 BC1代個體數(shù)據(jù)的模擬

性狀表型值的模擬：BC1群體中個體數(shù)量性狀表型值由QTL基因型值（QTL genotypic value）、多基因效應(yīng)值（polygenic value）和環(huán)境效應(yīng)（environmental effect）值3部分構(gòu)成.即：yi=vi+ui+ei,其中,vi為個體的QTL基因型值,由個體的QTL基因型決定；u為個體的多基因效應(yīng)值,服從N(0,分布,由計算機程序隨機產(chǎn)生；ei為環(huán)境效應(yīng)值,服從N(0,)分布,由程序隨機產(chǎn)生.

1.2 分析方法

1.2.1 最大似然分析對于回交群體,采用Lander和Botstein[6]提出的區(qū)間定位（interval mapping）法,如在相鄰標(biāo)記Mk-1和Mk構(gòu)成的區(qū)間內(nèi)存在影響目標(biāo)數(shù)量性狀的QTL,則個體的性狀表型值可由如下線性模型表示：yi=μ+bxi+ei（i=1,2,…,n）.其中,yi為個體的數(shù)量性狀觀察值；μ為模型的均值；xi為QTL基因型的指示變量,取值為1或0,相應(yīng)的概率由雙側(cè)標(biāo)記基因型和QTL位置所決定；b為QTL指示變量xi的回歸系數(shù),表示假定QTL的效應(yīng)；ei為隨機殘差,服從N(0,)分布.

1.2.2 似然函數(shù)該模型的分布為混合正態(tài)分布（mixed normal distribution）,似然函數(shù)為：

2 結(jié)果與分析

2.1 QTL位置的估計

不同標(biāo)記密度（相鄰標(biāo)記間圖距）水平下區(qū)間定位法對QTL位置估計值、MSE和檢驗統(tǒng)計量LOD值見表1.不同標(biāo)記密度下的LOD值變化曲線見圖1.

表1 不同標(biāo)記密度下QTL位置的估計值及其均方誤差

圖1 不同標(biāo)記密度下LOD值的變化曲線

從QTL位置參數(shù)的估計結(jié)果來看,并未呈現(xiàn)出標(biāo)記密度越高,QTL定位越準(zhǔn)確的規(guī)律.從檢驗統(tǒng)計量LOD值的變化情況看,標(biāo)記密度對LOD值的影響并不明顯,各個水平的變化未呈現(xiàn)出規(guī)律性.這與目前采用連鎖分析方法進(jìn)行畜禽QTL定位的置信區(qū)間幾乎都在5 cM以上的實際是相符的.

2.2 QTL效應(yīng)值的估計

不同標(biāo)記密度水平下區(qū)間定位法對QTL基因型加性效應(yīng)的估計值及其MSE見表2.不同標(biāo)記密度下QTL加性效應(yīng)估計值的剖面圖見圖2.

表2 不同標(biāo)記密度下QTL效應(yīng)估計值及其均方誤差

圖2 不同標(biāo)記密度下QTL效應(yīng)估計值曲線

從表2可以看出,QTL加性效應(yīng)的估計值與其真值的偏差未呈現(xiàn)規(guī)律性的變化.從QTL效應(yīng)值估計的MSE看,在相鄰標(biāo)記間圖距為5 cM和10 cM時較小,QTL效應(yīng)估計的結(jié)果精確性較高；相反,當(dāng)標(biāo)記密度為2 cM、20 cM時,均方誤差較大,QTL效應(yīng)估計的精確性稍低.

3 討論

在早期的QTL定位研究中,人們往往將檢出率的高低作為衡量QTL定位效果的指標(biāo)[8-9],但檢出率是一個很容易達(dá)到較高水平的統(tǒng)計量.從本文的結(jié)果來看,很多情況下,檢出率均為100%,而QTL位置估計值的均方誤仍然很大.也就是說,QTL定位的精確性仍然很低,而標(biāo)記輔助選擇（markerassistedselection, MAS）的相對效率在很大程度上取決于QTL定位的精確性.因此,QTL定位的精確性要比QTL檢測效率更具有意義.利用分子標(biāo)記對控制數(shù)量性狀的QTL進(jìn)行定位,并對其遺傳效應(yīng)進(jìn)行估計,是近年來數(shù)量遺傳學(xué)的新發(fā)展[10],這為育種上借助分子標(biāo)記輔助選擇提高數(shù)量性狀的選種效果奠定了基礎(chǔ),也是進(jìn)一步在DNA水平上對QTL進(jìn)行遺傳操縱的前提.

多年來,提高畜禽遺傳圖譜上的標(biāo)記密度一直是人們追求的目標(biāo).因為從理論上說,圖譜上的標(biāo)記密度越高,相鄰標(biāo)記間的距離就越小,QTL定位的置信區(qū)間也越小.然而本文的結(jié)果則顯示,在BC1設(shè)計下采用傳統(tǒng)的區(qū)間定位法進(jìn)行QTL定位,當(dāng)圖譜上相鄰標(biāo)記間的圖距從20 cM縮小到5 cM時,QTL位置估計的誤差均方從90.80×10-5降低到了7.77×10-5,但當(dāng)相鄰標(biāo)記間的圖距進(jìn)一步縮小到2 cM時,QTL位置估計的誤差均方反而又上升到了40.40×10-5.從本文所涉及的4種標(biāo)記密度看,以相鄰標(biāo)記間的圖距為5 cM時最有利于保證QTL定位的精確性,其效應(yīng)的估計結(jié)果也更為可靠.

王菁等[11]研究表明在不同因素水平組合下QTL定位的準(zhǔn)確性隨標(biāo)記密度的加大而變化趨勢略有不同；Riquet[12]、Meuwissen等[13]和劉會英[14]模擬連鎖不平衡定位的研究中,發(fā)現(xiàn)采用高密度標(biāo)記時,定位的結(jié)果與理論水平還有一定差距.本研究中QTL的效應(yīng)估計值在不同標(biāo)記密度下變化不穩(wěn)定,趨勢也略有不同,與上述學(xué)者的研究結(jié)果類似.理論上講,增加標(biāo)記密度可以提高QTL定位精確性,但從以上的研究結(jié)果來看,盡管標(biāo)記密度相對較大,仍沒能充分利用所有的標(biāo)記信息.另外,標(biāo)記密度過高,我們將很難區(qū)別相鄰區(qū)間之間的差異；反之,如果標(biāo)記密度過低,我們可能檢測不到標(biāo)記和QTL的連鎖不平衡,從而無法實施QTL定位.

QTL定位分析比較復(fù)雜,一方面是由于統(tǒng)計方法問題,另一方面是由于分子標(biāo)記技術(shù)操作比較復(fù)雜而且費用昂貴,因此對QTL作圖效率問題進(jìn)行研究非常必要,即以較少的分子水平上的樣本數(shù)據(jù)來對QTL作出精確的定位.目前在QTL作圖領(lǐng)域,一個具有普遍性的問題是對于標(biāo)記-QTL連鎖缺乏有效的統(tǒng)計檢驗方法.在具體試驗中,即使標(biāo)記和QTL之間不存在連鎖,他們之間重組率的估計值通常也小于0.50[15].

迄今為止,遺傳標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,在主要畜種基因組中可實現(xiàn)0.5～3.0 cM高飽和密度的遺傳圖譜[16],并且隨著SNP技術(shù)的日臻成熟,標(biāo)記間隔將進(jìn)一步縮小.豐富的標(biāo)記資源強有力地推動著QTL定位研究的發(fā)展,同時也呈現(xiàn)給我們較為現(xiàn)實的難題：選擇多少個標(biāo)記座位可滿足QTL定位的需要,尤其對于標(biāo)記-QTL連鎖分析,過低密度標(biāo)記降低連鎖分析的準(zhǔn)確性和精確性,過高密度的標(biāo)記會降低座位間重組事件的發(fā)生次數(shù)而影響分析效果[17],因此采用合理的標(biāo)記數(shù)目顯得尤為重要.Doerge等[17]提出了標(biāo)記利用的合理策略：采用較低密度、均勻分布基因組的標(biāo)記圖譜進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位.張勤[18]進(jìn)一步總結(jié)了利用遺傳圖譜信息進(jìn)行QTL定位研究的具體思路和總體策略：①通過連鎖分析將QTL定位在5～20cM區(qū)間的特定區(qū)段；②利用該區(qū)段的高密度標(biāo)記（間隔0.25～1 cM）,基于群體的連鎖不平衡,并利用歷史積累重組事件,實施QTL精細(xì)定位.

進(jìn)一步提高QTL檢測與定位的精度,實現(xiàn)精細(xì)定位和高效定位,是今后QTL定位研究的重點,除了要不斷改進(jìn)試驗設(shè)計外,合理優(yōu)化的統(tǒng)計分析方法也是必不可少的,統(tǒng)計方法的好壞直接影響著QTL檢測定位的準(zhǔn)確性和可靠性.采用連鎖不平衡分析是今后家畜經(jīng)濟(jì)性狀QTL精細(xì)定位的主要手段,根據(jù)連鎖不平衡原理,在QTL定位方面人們普遍考慮采用一些新的定位策略,利用群體的連鎖不平衡來尋找與QTL連鎖最緊密的標(biāo)記.雖然在QTL精細(xì)定位方面連鎖不平衡分析優(yōu)勢明顯,但其定位效力受到標(biāo)記與QTL間連鎖不平衡程度的限制,因此有必要結(jié)合連鎖平衡的一些優(yōu)點,進(jìn)行QTL精細(xì)定位[19].

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（責(zé)任編輯：鄧天福）

Effect of marker density on QTL mapping in a backcross design

Wang Xianping1,Lu Shaoxiong2
（1.College of Life Science,Henan University,Kaifeng 475001,China；2.College of Animal Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China）

Using simulation of computer method,the effects of marker density on the accuracy of quantitative trait locus（QTL）mapping,measured with mean squared error（MSE）of QTL position and effect estimates,were investigated for a backcross design.The results indicated that when the map distance of two adjacent markers was above 5 cM,it was useful for improving the accuracy of QTL mapping to increase marker density.However,when the map distance of two adjacent markers was shortened to 2 cM,increasing the marker density more had no effect on improving QTL mapping,which owing to the limit of marker-QTL linkage analysis.Marker density had no obvious effect on limit of detection value.

backcross design；marker density；QTL mapping；likelihood method

S813.2

A

1008-7516（2012）01-0032-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2012.01.008

2011-12-28

河南大學(xué)重點科研項目“影響畜禽QTL定位精確性的主要因素研究”

王鮮萍（1979-）,女,山西大同人,研士,講師.主要從事動物遺傳育種與繁殖研究.