李全健 ，王彩霞 ，田 敏 ，李翠新

（1.西南林業(yè)大學，云南 昆明 650224；2.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400）

扇脈杓蘭（Cypripedium japonicum Thunb.）屬蘭科（Orchidaceae）杓蘭屬（Cypripedium Linn.），生于海拔1 000～2 000 m的灌木林下、林緣、蔭蔽山坡等濕潤和腐殖質(zhì)豐富的土壤上[1]。目前對于扇脈杓蘭的研究主要集中在傳粉生態(tài)學[2]方面，有關(guān)扇脈杓蘭分子生物學相關(guān)的研究尚未見報道。

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是限制性片斷長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)的結(jié)合[3]，是一種理想的分子標記技術(shù)。已經(jīng)在杜仲[4]、蘋果[5]、葡萄[6]等多種植物[7-8]上建立了AFLP體系，并對菊花[9]、紅花[10]等多種植物進行了遺傳多樣性研究。盡管AFLP標記技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是其操作復雜，操作中的影響因素較多。建立扇脈杓蘭AFLP體系，對進一步研究其種質(zhì)資源多樣性和分子標記輔助育種有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為野生扇脈杓蘭嫩葉，取材后立即放入冰盒中帶回實驗室，保存在-80℃冰箱中。

1.2 方法

SDS 法[11]、高鹽低 pH 法[12]、常規(guī) CTAB 法[11]、高鹽CTAB法（將常規(guī)CTAB法提取緩沖液中的Na－Cl的濃度由 1.4mol/L增至 2.0mol/L，其它和常規(guī)CTAB法相同）和改良CTAB法。

試驗步驟：將材料研磨成粉末后，取約50 mg的凍粉于離心管中再加入CTAB（50mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、0.7 mol/L NaCl）200 μL 和10μLβ-巰基乙醇，充分混勻后加入800μL 65℃預(yù)熱的CTAB和10μL蛋白酶K，顛倒數(shù)次，65℃恒溫水浴 60 min，10 min/次搖勻；取出冷卻后加入800 μL 酚∶氯仿∶異戊醇（體積比為 25∶24∶1），顛倒混勻 2 min，靜置 5 min后12 000 r/min離心 15 min；取上清液，加等體積的氯仿∶異戊醇（體積比為24∶1）顛倒 2 min，靜置5min后12 000 r/min離心 15 min；取上清液，加1/10體積5mol/L的醋酸鈉和等體積的異丙醇，沉淀15 min。8 000 r/min離心10 min，去上清；70%乙醇洗滌兩次，風干后溶于400 μL去離子水；加入10μL RNase，37℃消化 1 h，65℃水浴20min，稍冷卻加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混勻后 12 000 r/min 離心 15 min；取上清液，加入1/10體積5mol/L的醋酸鈉和兩倍體積-20℃無水乙醇，－20℃ 沉淀 20 min；8 000 r/min 離心10min；70% 乙醇洗滌兩次（10min/次），風干后加40μL去離子水，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA純度及濃度檢測

取 5μL DNA 樣品，加 1 μL 6×Loading buffer，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳；用紫外分光光度計檢測總DNA在260 nm和280 nm處的吸光值。根據(jù)電泳譜帶和A260/A280值判斷DNA的純度，根據(jù)公式：DNA 濃度（μgmL-1）=A260×50 μg/mL×稀釋倍數(shù)，計算總DNA的濃度。

1.4 限制性內(nèi)切酶酶切分析

1.4.1 酶切體系 酶切反應(yīng)體系為20μL，各組份為：模板 DNA 1μg，10×NEB 緩沖液 2.0 μL，EcoRⅠ（10 U/L）0.5 μL，MseⅠ（10 U/L）0.5 μL，BSA 0.2 μL，加雙蒸水至20μL。為了獲得扇脈杓蘭DNA酶切的最佳反應(yīng)時間，酶切時間分別設(shè)為 1、2、3、4、5 h。酶切消化后，65℃ 滅活20min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。

1.4.2 連接體系 在20μL反應(yīng)體系中加入10 μL酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液2.0μL，MseⅠ接頭 1.0μL，EcoRⅠ接頭 1.0 μL，T4 DNA連接酶（400 U/L）1.0 μL，滅菌雙蒸水5 μL。16℃連接反應(yīng)90min，連接反應(yīng)結(jié)束后，65℃滅活20min。

1.4.3 擴增體系 初始擴增體系參照相關(guān)研究論文和常規(guī)的PCR反應(yīng)中各組分的量，確定扇脈杓蘭AFLP初始反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積50μL，內(nèi)含0.25 μL Ex Taq，5.0 μL 10×Ex Taq buffer，4.0 μL dNTPMixture，4μLMg2+，模板 DNA 2.5 ng，M00 和E00各2.0μL，加滅菌蒸餾水至 50μL。對AFLP反應(yīng)體系中的5種反應(yīng)成分分別進行單因素試驗（見表1），確定合適反應(yīng)條件。

表1 PCR反應(yīng)體系中處理因素和水平

預(yù)擴增程序為95℃預(yù)變性5 min；然后進行30個循環(huán)：95℃變性 30 s，56℃復性 30 s，72℃ 延伸 60 s；循環(huán)后 72℃延伸 10min；10℃保存。

選擇性擴增程序為：94℃ 5 min；94℃變性30 s，65℃復性 30 s，72℃延伸 70 s；65～56℃ （每個循環(huán)降0.7℃）退火30 s，72℃延伸70 s，共13個循環(huán)；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 70 s，共 24個循環(huán)；72℃延伸10min，10℃ 保存。

1.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 取6μL（含上樣緩沖液）樣品，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h（80W 恒功率）。電泳結(jié)束后，銀染、拍照，從中選擇譜帶清晰和容易計數(shù)的引物作為AFLP反應(yīng)的最佳引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測結(jié)果

圖1所示為改良CTAB法提取基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠電泳電泳圖，DNA電泳條帶清晰無拖尾，點樣孔無污染，DNA無降解，大小在23 000 bp左右。

圖1 改良CTAB法提取的基因組DNA瓊脂糖電泳圖

2.2 紫外檢測結(jié)果

由表2所示：5種提取方法在去除蛋白質(zhì)、多糖及酚類等污染物方面存在差異。改良CTAB法得到的DNA A260/A280在1.8～2.0之間，說明污染物去除較為完全，DNA純度高。如果A260/A280<1.8，說明DNA被蛋白質(zhì)或多糖污染。A260/A280>2.0，說明RNA未去除干凈。

表2 不同方法提取總DNA結(jié)果的比較

2.3 限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果

AFLP分析中基因組 DNA常采用雙酶切，通常一個為稀有堿基切點酶，另一個為常見堿基切點酶。根據(jù)圖2可知，酶切產(chǎn)物電泳均勻，無主條帶，主要分布在100～1 000 bp之間，說明酶切消化良好，可以用于分子標記。

圖2 酶切效果

2.4 AFLP選擇性擴增反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 預(yù)擴增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)對擴增結(jié)果的影響由圖3可知，在設(shè)定的6個稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)均能擴增出清晰譜帶，然而，濃度較大時（稀釋5～20倍），小片段的譜帶較清晰，當濃度較小時（稀釋40～80倍），大片段的譜帶清晰可見，而小片段的譜帶變?nèi)酢Ｒ虼诉x定產(chǎn)物稀釋20倍為模板DNA。

圖3 預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對選擇性擴增的影響

2.4.2 dNTP用量對擴增的影響 由圖 4可知dNTP使用量對擴增的影響較大。當dNTP的用量為3.0～4.0μL時擴增條帶均清晰穩(wěn)定，擴增的產(chǎn)物濃度較高；用量少于2.0μL時擴增條帶較弱，而用量多于4.0μL（4.0～10μL）時擴增產(chǎn)物變化不大，而且擴增條帶減少且不清晰。說明dNTP濃度太低或太高都會使擴增產(chǎn)物減少，影響擴增效果。因此選擇3.0～4.0μL為dNTP的適宜用量。

圖4 dNTP濃度對選擇性擴增的影響

2.4.3 Mg2+用量對擴增的影響 圖5顯示不同Mg2+使用量條件下的PCR擴增結(jié)果。結(jié)果顯示，2.0 μL的Mg2+用量太低，影響了DNA聚合酶的活性，基本上沒有產(chǎn)物或者產(chǎn)物的量較少；用量為3.0～10 μL下擴增條帶均清晰穩(wěn)定，考慮到Mg2+用量過大時容易出現(xiàn)非特異性條帶，因此，選擇3.0～4.0μL作為Mg2+最優(yōu)使用量。

圖5 Mg2+濃度對選擇性擴增的影響

圖6 引物用量對選擇性擴增結(jié)果的影響

2.4.4 引物用量對擴增的影響 引物使用量對擴增的影響較為顯著。由圖6可見，引物用量為1.5～2.0μL時擴增譜帶較為清晰，少于1.5μL時譜帶變?nèi)跎踔翢o擴增產(chǎn)物，而用量大于2.0μL（4～6μL）時，譜帶出現(xiàn)特異性條帶，且位點發(fā)生變異，可能是引物濃度過高產(chǎn)生的錯配現(xiàn)象。因此，選擇1.5～2.0 μL為引物的最佳使用量。

2.4.5 Taq DNA聚合酶用量對擴增的影響 圖7表明，隨著Taq DNA聚合酶用量的增加，譜帶也越來越明亮，Taq聚合酶的用量少時（0.1μL），擴增條帶亮度小，說明產(chǎn)物濃度??；但使用量在0.2～0.6 μL的范圍內(nèi)譜帶明亮，擴增產(chǎn)物濃度較高，之間亮度在增加但差異不明顯。在節(jié)省又不影響試驗結(jié)果的前提下，選取用量0.2～0.3μL可達到試驗要求。

圖7 Taq DNA聚合酶用量對選擇性擴增的影響

2.5 AFLP反應(yīng)體系穩(wěn)定性的鑒定

圖8為24對引物對優(yōu)化體系的驗證，引物編碼記為 E11/M1，E11/M2，E11/M12 和 E12/M1，E12/M2……E12/M12。體系各組分的最佳用量為預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍液4.0μL，dNTP 3.0μL，引物1.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL，Mg2+4.0 μL，每對引物一個重復，以鑒定扇脈杓蘭AFLP反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖8所示，24對引物在2個DNA中均能擴增出清晰可辨的譜帶，經(jīng)反復試驗表明，利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系能有效地對扇脈杓蘭7個不同群體DNA進行AFLP擴增，而且具有較好的穩(wěn)定性和可重復性，可以推斷，優(yōu)化后的AFLP反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。

圖8 不同引物選擇性擴增電泳圖

3 討 論

植物組織中的多糖、酚、酯和萜等次生代謝物質(zhì)會對DNA的提取造成較大的困難，樣品不純，會影響后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)扇脈杓蘭葉片中多糖、蛋白質(zhì)、酚類化合物、等次生代謝產(chǎn)物的含量較高。在提取過程中加入β-巰基乙醇，能夠與多酚物質(zhì)競爭可防止葉片中的多酚物質(zhì)氧化而使DNA呈褐色。高濃度醋酸鈉的引入及相應(yīng)的低溫冰凍，可以提高扇脈杓蘭基因組DNA的純度和得率，建議在提取扇脈杓蘭次生代謝物質(zhì)含量高的植物基因組DNA時采用。

AFLP反應(yīng)是先進行酶切消化，再對連接產(chǎn)物進行選擇性擴增。酶切時間過短，則消化不完全，接頭難以連接；時間過長，不僅會延長整個試驗周期，而且容易出現(xiàn)星號活性。酶切與連接的時間應(yīng)控制適當，以確保酶切消化完全和連接充分。預(yù)擴增產(chǎn)物的濃度對選擇性擴增影響很大，模板濃度過高會引起非特異性擴增；稀釋倍數(shù)過大，PCR產(chǎn)物過少，影響統(tǒng)計分析。并且體系各組分的多少都會對選擇性擴增產(chǎn)生影響。只有對各因素的用量篩選后，才能建立具有較高穩(wěn)定性的AFLP反應(yīng)體系。

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