朱桃桃，王安紅，周 昆，盧國(guó)彥，馬志會(huì)

2010版藥典首次將乳香、沒(méi)藥收錄其中，乳香、沒(méi)藥均有活血止痛的功效，常作為對(duì)藥使用，但藥典中并未有乳香、沒(méi)藥毒性的記載。五味是指藥物因功效不同而具有辛、甘、酸、苦、咸味，五味與歸經(jīng)、毒性有關(guān)系，五味是產(chǎn)生毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，藥物的毒性主要來(lái)自辛、苦味；五味歸經(jīng)具有普遍性，其中以歸肝經(jīng)者為多，苦、咸味主歸肝經(jīng)，辛味主歸肺、脾、肝經(jīng)[1]。乳香，辛、苦，溫，歸心、肝、脾經(jīng)；沒(méi)藥，辛、苦，溫，歸心、肝、脾經(jīng)[2-3]。本組實(shí)驗(yàn)人員在研究中也發(fā)現(xiàn)乳香、沒(méi)藥對(duì)Beagle犬及大鼠有較明顯的肝臟毒性，肝內(nèi)可見(jiàn)輕度膽汁淤積[4-5]。筆者觀察了乳香、沒(méi)藥對(duì)大鼠膽汁分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 受試藥 乳香、沒(méi)藥（購(gòu)自天津市順時(shí)德大藥房），粉碎后以生藥粉給藥。

1.2 動(dòng)物 Wistar大鼠 [購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（津）2009－0001]，所用飼料為全價(jià)顆粒飼料（天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn)），飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試劑和儀器 總膽汁酸（TBA）試劑盒（中生北控生物科技有限公司），谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所），JJ2000精密電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠），AE200S電子分析天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司），Micro95半自動(dòng)生化儀（荷蘭威圖科學(xué)公司），Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司），DYY—IIIB電泳儀（北京六一儀器廠），轉(zhuǎn)膜裝置（Bio－Rad，美國(guó)），ENEGENIUS凝膠成像系統(tǒng)（Bio Imaging System，Syngene，英國(guó)）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及樣本采集 Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組9只、乳香組12只、沒(méi)藥組11只、乳香沒(méi)藥組10只，各給藥組劑量均為生藥3 g/kg，按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃給藥2周，對(duì)照組給予等體積的自來(lái)水。末次給藥后麻醉動(dòng)物，腹中線開(kāi)2 cm切口，在十二指腸腸系膜處分出膽管，在距十二指腸2 cm的膽管處切口插入塑料軟管，收集給藥后0.5～1.5 h內(nèi)的膽汁。膽汁收集完后取肝臟，將收集標(biāo)本置于-70℃超低溫冰箱凍存。

1.4.2 TBA和GSH檢測(cè) 將收集的膽汁用半自動(dòng)生化儀分別測(cè)試TBA、GSH含量，其中測(cè)膽汁TBA時(shí)將膽汁稀釋100倍。TBA采用酶循環(huán)法，GSH采用比色定量測(cè)定法。

1.4.3 肝臟膽鹽輸出泵（BSEP）和法尼醇X受體（FXR）檢測(cè) 提取肝組織蛋白，蛋白樣品置于SDS變性聚丙烯酞胺凝膠上電泳，將分離的蛋白條通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。分別用非標(biāo)記一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。電泳條件為80 V，30 min；濕轉(zhuǎn)條件為65 V轉(zhuǎn)膜2 h。一抗稀釋比例（1∶1 000），二抗稀釋比例（1∶3 000）。

1.4.4 高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè) 將收集的膽汁用乙酸乙酯萃取渦旋2 min，5 000 r/min離心10 min，取有機(jī)層氮?dú)獯蹈?，用甲醇?fù)溶進(jìn)樣。乳香、沒(méi)藥生藥粉同膽汁相同方法處理進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱AgilentTC-C18（4.6mm×150mm，5.0 μm）。流動(dòng)相為乙腈∶水＝65∶35；流速 1.0 mL/min；柱溫30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。進(jìn)樣量20 μL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，正態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳香、沒(méi)藥對(duì)大鼠膽汁流量及膽汁中TBA、GSH的影響 乳香、沒(méi)藥和乳香沒(méi)藥組大鼠膽汁流量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。膽汁中TBA濃度各給藥組均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），乳香組明顯低于沒(méi)藥組（P＜0.01）；GSH 濃度各給藥組均低于對(duì)照組（P＜0.05），乳香、乳香沒(méi)藥組明顯低于沒(méi)藥（P＜0.01）。通過(guò)膽汁分泌的TBA量乳香、乳香沒(méi)藥組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），乳香組明顯低于沒(méi)藥組（P＜0.05）；而通過(guò)膽汁分泌的 GSH 量各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.2 BSEP、FXR蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，各給藥組BSEP蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)XR有上升的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

表1 乳香、沒(méi)藥對(duì)大鼠膽汁流量的影響（s）

表1 乳香、沒(méi)藥對(duì)大鼠膽汁流量的影響（s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 n 膽汁量（mL）對(duì)照組 9 0.91±0.20乳香組 12 1.65±0.43**沒(méi)藥組 11 1.33±0.26*乳香沒(méi)藥組 10 1.50±0.68**

表2 乳香、沒(méi)藥對(duì)大鼠TBA、GSH的影響（s）

表2 乳香、沒(méi)藥對(duì)大鼠TBA、GSH的影響（s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與沒(méi)藥組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

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圖1 BSEP、FXR蛋白的表達(dá)

2.3 HPLC分析 由膽汁及生藥液相色譜可知，乳香、沒(méi)藥均有多種成分進(jìn)入膽汁，在此色譜條件下主要集中在2～5 min，見(jiàn)圖2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)給予乳香、沒(méi)藥2周能增加大鼠膽汁流量，但排入膽管的TBA量減少，且乳香對(duì)膽汁流量及TBA分泌量的影響強(qiáng)于沒(méi)藥。肝細(xì)胞通過(guò)膽汁分泌的TBA量減少會(huì)導(dǎo)致TBA在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)度蓄積，這可能是乳香、沒(méi)藥導(dǎo)致肝損傷的一個(gè)原因。

圖2 膽汁及生藥的HPLC圖

肝臟是藥物從體內(nèi)清除的主要場(chǎng)所，膽汁排泄是許多化合物的代謝及消除途徑。膽汁的形成是由于膽汁酸鹽和其他有機(jī)離子通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸方式進(jìn)入毛細(xì)膽管，造成滲透壓梯度，使水被動(dòng)排入從而形成膽汁流。膽流主要分為膽鹽依賴性膽流和膽鹽非依賴性膽流兩種，TBA及GSH分別是膽鹽依賴性膽流和膽鹽非依賴性膽流的主要驅(qū)動(dòng)力[5]。BSEP是膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，GSH的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體是多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）[6-8]，作為膽汁酸的受體FXR可以直接結(jié)合在BSEP的啟動(dòng)子上調(diào)控BSEP的表達(dá)來(lái)維持膽汁酸的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。乳香、沒(méi)藥均能增加膽汁流量，但膽汁中TBA、GSH濃度均大幅降低，并且乳香、乳香沒(méi)藥組通過(guò)膽汁分泌的TBA量也顯著減少，而通過(guò)膽汁分泌的GSH量無(wú)明顯變化，提示MRP2蛋白的表達(dá)沒(méi)有受到影響，而B(niǎo)SEP的表達(dá)可能受到了抑制。但是接下來(lái)的BSEP蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，BSEP的表達(dá)并沒(méi)有受到抑制。TBA、GSH是膽汁流的主要驅(qū)動(dòng)力，其排出量降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致膽汁流量減少，而乳香、沒(méi)藥在使膽汁排出的TBA量顯著降低的情況下膽汁流量反而增加了，在排除了BSEP蛋白表達(dá)受抑制的前提下，推測(cè)乳香、沒(méi)藥有成分通過(guò)BSEP轉(zhuǎn)運(yùn)至膽汁，或可以抑制BSEP的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。對(duì)膽汁及乳香、沒(méi)藥生藥萃取物的HPLC分析結(jié)果顯示，給藥組膽汁中存在乳香、沒(méi)藥的多種成分，證實(shí)乳香、沒(méi)藥有的成分可通過(guò)膽汁分泌。本實(shí)驗(yàn)表明乳香、沒(méi)藥排入膽管使膽汁流量增加，對(duì)TBA的排出形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使TBA濃度降低，但乳香、沒(méi)藥轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)載體有哪些還有待于進(jìn)一步的研究。

[1]周 昆，代 志，柳占彪，等.壯骨關(guān)節(jié)丸中肝毒性藥材的篩選研究[J].中國(guó)藥物警戒，2009，6(11):641.

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[3]韓淑芬，金仲品.沒(méi)藥的藥理活性研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（6）：1502-1506.

[4]談 英，徐 鑫，周 昆，等.乳香沒(méi)藥及其提取物對(duì)大鼠肝毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(6):221.

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