魯 莽

(景德鎮(zhèn)陶瓷學院材料科學與工程學院，江西 景德鎮(zhèn) 333403)

植物根系能向根際釋放多種有用的小分子化合物。陸生植物所能經歷的一些復雜的物理、化學和生物的相互作用，通常出現(xiàn)在根系與其周圍的土壤環(huán)境即根際間，如根-根、根-昆蟲以及根-微生物之間。過去數十年來，學術界在不懈地努力探索這些不同類型的相互作用[1]，其中根系分泌物在調節(jié)這些生物相互作用中的重要性已被認可[2～4]。根際代表一個高度動態(tài)的相互作用的前線，位于根系與致病或有益土壤微生物、無脊椎動物及競爭性根系之間[1]。然而，因為植物根系深藏在地下，其中的許多現(xiàn)象難為人知，尤其是一些化學信息在調節(jié)地下生物相互作用中的角色才剛被認識。植物根系與其它土壤微生物和鄰近植物根系間的化學信息傳遞通常基于根誘導的化學物質。同一化學信息可對不同的受體誘導出相異的響應。根系分泌物的化學成分可阻止某一生物體而吸引另一生物體，也可能吸引兩種對植物有不同作用的差異很大的生物體。

根系分泌物的產生量隨植物的種類、栽培品種、株齡及脅迫因素而異。大量的有機化合物釋放在幼根表面[5]，這些物質有高分子量的多聚糖和多種低分子量的有機物，如簡單的多糖(樹膠醛糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、寡糖)、氨基酸(精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、天冬酰胺酸、谷氨酸)、有機酸(乙酸、安息香酸、蘋果酸、阿魏酸)和酚類物質等。此外，根系也以較大的量釋放一些大分子物質諸如類黃酮、酶、脂肪酸、生長調節(jié)劑、核苷酸、丹寧酸、類固醇、類萜、生物堿、多炔、維生素等。這些化合物中的多種涉及到初級或次級的植物代謝過程和植物抗性[6]。作者在此收集人工培養(yǎng)得到的植物(黑麥草、高羊茅及紫花苜蓿)根系及其分泌物，并探討其對微生物生長及活性的影響。

1 實驗

1.1 材料和試劑

輕質原油(飽和烴65.14%，芳烴24.37%，膠質9.02%，瀝青質1.47%)，大港油田。

高羊茅、黑麥草和紫花苜蓿為試驗用植物，種子購自北京百綠公司。

二氯甲烷及其它試劑均為分析純。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

實驗室篩選保存的原油降解優(yōu)良菌株W，經鑒定為芽孢桿菌。

Bushell-Hass基礎培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eCl30.05 g，CaCl2·H2O 0.02 g，蒸餾水1 L，pH值7.0，121 ℃蒸汽滅菌15 min。

1.3 植物根系及其分泌物的制備

植物種子經3% H2O2浸泡30 min后，用去離子水沖洗3次。將滅菌后的種子播撒于覆蓋在燒杯口的紗布上，燒杯中盛滿半強度Hoagland′s營養(yǎng)液，液面稍稍沒過紗布。播種后燒杯放于人工氣候箱中，培養(yǎng)條件：白天16 h，溫度24 ℃，光照強度6000 lx，濕度80%；夜晚8 h，溫度20 ℃，濕度80%。植物每隔1 d用無菌水補充液位，并每7 d補充1次半強度Hoagland′s營養(yǎng)液。植物培養(yǎng)28 d后，進行收獲。剪去葉片，塑料袋包裝密封，4 ℃保存。使用前將根剪成約1 cm長小段。根系分泌物溶液以0.2 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

1.4 根系及其分泌物對微生物生長的影響

以保存?zhèn)溆玫母导捌浞置谖餅榛|，考察其對菌株W生長狀況的影響，實驗分2個處理:(a)菌株W+40 mL Bushell-Hass基礎培養(yǎng)基+0.1 g碎根；(b)菌株W+35 mL Bushell-Hass基礎培養(yǎng)基+5 mL根系分泌物。

將菌株W活化2 d，8000 r·min-1離心收集菌細胞，無菌水洗滌3次后重新懸浮于磷酸鹽緩沖溶液中，制得培養(yǎng)液，測得OD600為0.8。按每瓶接種量1 mL接種培養(yǎng)液，30 ℃下150 r·min-1培養(yǎng)20 d。每12 h測定培養(yǎng)液的OD600，以ΔOD600(ΔOD600=OD600-0.8)表征總的微生物細胞生長量。

1.5 根系及其分泌物對原油降解和脫氫酶活性的影響

考察根系及其分泌物對原油降解的影響，實驗分3個處理：(a)菌株W+40 mL Bushell-Hass基礎培養(yǎng)基；(b)菌株W+40 mL Bushell-Hass基礎培養(yǎng)基+0.1 g碎根；(c)菌株W+35 mL Bushell-Hass基礎培養(yǎng)基+5 mL根系分泌物。

在4個三角瓶中加入0.02 g輕質原油，121 ℃蒸汽滅菌15 min，留一瓶作空白，其余冷卻后分別加入根及其分泌物。按每瓶接種量1 mL接種培養(yǎng)液，30 ℃下150 r·min-1培養(yǎng)20 d。在第5 d、10 d、15 d、20 d按重量法測定殘余油量，計算原油的降解率。

測定菌液脫氫酶活性(DHA)，單位為μg TPF·mL-1·(6 h)-1。

2 結果與討論

2.1 根系對微生物生長的影響(圖1)

圖1 加有3種植物根系的培養(yǎng)基ΔOD600隨時間的變化

從圖1可知，菌株W能夠利用3種植物碎根中的營養(yǎng)物質為唯一碳源和能源，這驗證了植物學領域的一個理論，即根際微生物可利用根系老化腐爛所釋放出的營養(yǎng)物質而增殖，并強化根際污染物的降解。

在最初的12 h內，各處理的ΔOD600分別從0增加到0.051(高羊茅)、0.056(黑麥草)、0.041(紫花苜蓿)。高羊茅和黑麥草根系處理的ΔOD600在36～48 h增加最快，之后達到穩(wěn)定期并有所下降。這是因為，根系的營養(yǎng)物質是逐步釋放的，隨著微生物的生長，根系在這一環(huán)境中開始腐解而逐步釋放有機物，當腐解所能釋放的有機物達到最大值時，微生物生長急劇加快；隨著營養(yǎng)物質的消耗，有機物量減少，微生物生長又逐漸減緩。紫花苜蓿的ΔOD600突增期在48～60 h，比高羊茅和黑麥草的突增期推遲了12 h。這可能是因為，紫花苜蓿系豆科植物，與同屬草本的高羊茅和黑麥草的根的理化性質有異。

高羊茅和黑麥草的根毛遠比紫花苜蓿的發(fā)達，這可能導致前者的根系在培養(yǎng)條件下腐解快于后者的根系。在栽培的植物中，根毛最多可貢獻高達77%的總根表面積[7]。根毛在植物生命進程中也扮演了重要的角色，如固定植株、吸收水分和營養(yǎng)、產生調節(jié)植物-微生物聯(lián)系的物質、調控植物生長以及決定植物根際微生物群落結構[8～10]?；罡突钚猿跎按紊硇缘蒯尫糯罅扛捣置谖铩８鶕参锓N類和經受環(huán)境條件的不同，活根毛系統(tǒng)在根體系結構(包括根毛數目和大小)方面差異很大。

需指出的是，由于不同種植物根系的有機物種類及含量不一致，因此不能因為某種根系處理下的微生物生長量比另一種根系處理下的更大，而認為某種根系比另一種根系對微生物的生長促進作用更顯著。最終，各處理的ΔOD600最大值分別為0.185(高羊茅)、0.192(黑麥草)、0.158(紫花苜蓿)。

2.2 根系分泌物對微生物生長的影響(圖2)

圖2 加有3種植物根系分泌物的培養(yǎng)基ΔOD600隨時間的變化

由圖2可知，3種植物的根系分泌物也能支持微生物的生長，且各處理樣的微生物生長量在24 h時均達到頂峰，隨后下降。這主要是因為，根系分泌物中的有機物都是溶解態(tài)的，可以迅速被微生物利用，而不像根系中的有機物需要靠腐解來逐步釋放。另外，可看到根系分泌物處理樣的微生物生長量要小于根系處理樣的微生物生長量，但不能由此判定根系對微生物生長的促進作用更大，因為所加入的根系及其分泌物所含營養(yǎng)物質的量不能確定一致。

2.3 根系對原油降解和脫氫酶活性的影響(圖3)

圖3 3種植物根系對原油累積降解率(a)和脫氫酶活性(b)的影響

由圖3可知，3種植物根系對原油降解同樣有促進作用。第5 d的原油降解率分別為22.5%(未添加)、29.8%(高羊茅)、34.5%(黑麥草)、27.4%(紫花苜蓿)，與微生物生長情況相似。此時，各處理間的原油降解率具有顯著差異(P<0.05)。5 d后，未添加與加有根系的處理樣間的原油降解率差距有一定程度的減小，這是因為5 d時根系營養(yǎng)物基本耗盡，導致對微生物的刺激作用減弱。因添加的根系已死亡，不可能對微生物產生持續(xù)性刺激。20 d時，原油降解率分別為47.6%(未添加)、60.5%(高羊茅)、61.2%(黑麥草)、54.8%(紫花苜蓿)。

由圖3還可知，根系可以提高脫氫酶的活性，這主要是有機營養(yǎng)物質的刺激作用所致。脫氫酶活性與原油降解基本呈正相關。

2.4 根系分泌物對原油降解和脫氫酶活性的影響(圖4)

圖4 3種植物根系分泌物對原油累積降解率(a)和脫氫酶活性(b)的影響

由圖4可知，3種植物根系分泌物促進原油降解也是集中在前5 d，且促進效果不如根系，與微生物生長實驗情況類似。第5 d的原油降解率分別為27.6%(高羊茅)、28.4%(黑麥草)、25.1%(紫花苜蓿)。高羊茅與黑麥草處理間差異不顯著，但與紫花苜蓿處理間有顯著差異(P<0.05)。20 d時，原油降解率分別為50.3%(高羊茅)、51.7%(黑麥草)、49.2%(紫花苜蓿)，要顯著低于加有相應根系處理的原油降解率。

由圖4還可知，根系分泌物也能提高脫氫酶活性，但持續(xù)的時間不如根系，這主要是由于根系分泌物的營養(yǎng)在開始培養(yǎng)后很快就被微生物吸收消耗了。

3 結論

通過無土培養(yǎng)獲得植物(黑麥草、高羊茅及紫花苜蓿)的根系及其分泌物，以搖瓶培養(yǎng)的方式考察了其對微生物生長及活性的影響。結果表明，黑麥草、高羊茅及紫花苜蓿的根系及其分泌物均能支持微生物的生長，并促進原油的降解。黑麥草與高羊茅處理間的差異不顯著，但這兩種草本植物與紫花苜蓿處理間有顯著差異。根系對微生物生長和原油降解的刺激效應持續(xù)時間比根系分泌物的刺激效應持續(xù)時間要長。

參考文獻：

[1] Bais H P， Vepachedu R， Gilroy S， et al. Allelopathy and exotic plant invasion:From molecules and genes to species interactions[J].Science，2003，301(5638):1377-1380.

[2] Hirsch A M，Bauer W D，Bird D M，et al.Molecular signals and receptors：Controlling rhizosphere interactions between plants and other organisms[J].Ecology，2003，84(4):858-868.

[3] Walker T S，Bais H P，Grotewold E，et al.Root exudation and rhizosphere biology[J].Plant Physiology，2003，132(1):44-51.

[4] Weir T L，Park S W，Vivanco J M.Biochemical and physiological mechanisms mediated by allelochemicals[J].Current Opinion in Plant Biology，2004，7(4):472-479.

[5] Rovira A D.Plant root exudates[J].The Botanical Review，1969，35(1):35-57.

[6] Bertin C，Yang X H，Weston L A.The role of root exudates and allelochemicals in the rhizosphere[J].Plant and Soil，2003，256(1):67-83.

[7] Parker J S，Cavell A C，Dolan L，et al.Genetic interactions during root hair morphogenesis inArabidopsis[J].The Plant Cell Online，2000，12(10)：1961-1974.

[8] Fan T W M，Lane A N，Shenker M，et al.Comprehensive chemical profiling of gramineous plant root exudates using high-resolution NMR and MS[J].Phytochemistry，2001，57(2):209-221.

[9] Grierson C S，Parker J S，Kemp A C.Arabidopsisgenes with roles in root hair development[J].Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2001，164(2):131-140.

[10] Michael G.The control of root hair formation：Suggested mechanisms[J].Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2001，164(2):111-119.