黃志剛 熊煥宏 黃曉春

單核細胞趨化蛋白-1與對乙酰氨基酚中毒肝損害

黃志剛 熊煥宏 黃曉春

目的MCP-1、CCR2在對乙酰氨基酚中毒急性肝損傷過程中的變化并探討其可能的作用機制。方法高效液相色譜法（HPLC）測定血漿中對乙酰氨基酚濃度； ELISA方法動態(tài)檢測血清中MCP-1、CCR2的濃度。結(jié)果16例對乙酰氨基酚血藥濃度達到中毒濃度，4小時后MCP-1、CCR2在血液中的表達明顯增加，12小時后均有所下降，但變化不明顯。結(jié)論高效液相色譜（HPLC）法能早期診斷乙酰氨基酚中毒；MCP-1、CCR2作為一對重要的炎癥介質(zhì)，可能參與了對乙酰氨基酚中毒急性肝損傷過程。

對乙酰氨基酚中毒；肝損害；單核細胞趨化蛋白-1；趨化性細胞因子受體2

對乙酰 氨基酚(醋酸酚)通常稱為撲熱息痛(acetaminophen，AAP)，是臨床上應用最為廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥物。在正常治療劑量時，對乙酰氨基酚耐受性好，副作用較少。過量使用則可導致嚴重的肝、腎功能損害乃至死亡。對乙酰氨基酚肝毒性在歐美國家已得到廣泛關注，但在我國尚未引起足夠的重視。報道顯示，25%爆發(fā)性肝衰竭和50%肝臟功能異?；颊吲c用藥有關，其中對乙酰氨基酚是引起肝衰竭并需要肝移植的首要藥物[1]。目前對乙酰氨基酚中毒致肝損傷的病理機制尚不明確。相對一致的觀點認為：對乙酰氨基酚肝毒性是從其肝臟代謝生成毒性中間體NAPQI開始的，進而引起一系列細胞毒性反應，具體過程有待進一步闡明【4】。

1 材料和方法：

1.1病例收集

25例，男性10例，女性15例，年齡17～56歲，均為懷疑對乙酰氨基酚急性中毒患者或自述中毒患者。

1.2標本取樣

自訴口服對乙酰氨基酚4小時、12小時后采血（如服藥時間不清即刻取樣）保存。

1.3試劑與標準品

MCP-1、CCR2試劑盒（RB公司），對乙酰氨基酚（中國藥品生物制品檢定所）。

1.4儀器和材料

全自動生化分析儀，Waters系列高教液相色譜儀。

1.5方法

高效液相色譜（HPLC）法測定血漿中對乙酰氨基酚濃度：對照溶液：儲備液為10 mg·ml-1甲醇溶液。工作溶液:由甲醇溶液逐級稀釋為 0.01～5 mg·ml-1。溶液，4℃ 冰箱存放備用。色譜條件采用Nova-PakC1b柱(4um，3.9 mm，150mm)和Nova-Pak C18預柱，柱溫：25℃。流動相為甲醇-水(30：30)，流速為0.8 m L·min-1，紫外渡長為254nm。血漿樣品：制備取靜脈血3～4 m1，置含肝素抗凝劑的離心管中。離心分離5 min(3000r·min-1)，上清液為待測血漿。取1ml上述血漿，加飽和硫酸鋅溶液1ml沉淀蛋白，加人乙醚 5 ml，渦漩混臺 1min，離心 20 min(3000r·min-1)。精密吸取乙醚液3.0 ml于50℃氮氣流吹干，冷至室溫。以蒸餾水500ul溶解殘渣，取10 ul進樣。以血藥濃度＞150ug/ml作為對乙酰氨基酚的中毒標準。用全自動生化儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶。按試劑盒說明書用 ELISA方法檢測血清中MCP-1、CCR2的表達。

2 結(jié)果

2.1 對乙酰氨基酚急性中毒患者血藥濃度（μ g.ml一-1）:152±59。

2.2 血液檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(μ/L) ALT1:107±40，ALT2:92±33 組間比較P=0.062。

2.3 MCP-1、CCR2在血液中的表達(ng/L)。

MCP-1 1:161±61，MCP-1 2:131±51，組間比較P=0.021（MCP-1 1為4小時采血、MCP-1 2為12小時采血）

CCR2 1：144±55 CCR2 2：91±28，組間比較P=0.038（CCR2 1與CCR2 2的說明同上）。

病例對乙酰氨基酚血藥濃度服藥時間(h)血液檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)1u/l血液檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)2 u/l MCP-1在血液中的表達1 MCP-1在血液中的表達2 CCR2在血液中的表達1 CCR2在血液中的表達2 1 213 4 148 134 221 171 198 114 2 126 14 112 102 103 98 106 96 3 178 時間不明 123 113 190 154 186 112 4 159 9 119 101 160 121 155 85 5 236 3 146 123 251 198 214 133 6 198 5 135 119 214 182 203 114 7 127 時間不明 104 93 145 112 132 68 8 181 6 115 99 195 160 178 102 9 169 時間不明 158 118 178 151 165 99 10 148 12 99 98 135 104 124 64 11 90 時間不明 41 36 89 64 86 67 12 184 8 132 117 186 160 171 92 13 155 時間不明 108 95 161 127 156 89 14 163 10 118 110 173 148 154 97 15 78 時間不明 42 38 85 56 54 52 16 205 6 131 112 231 188 188 105 17 232 5 145 120 254 186 219 167 18 60 20 45 40 70 55 57 59 19 0 6 38 37 53 50 55 54 20 188 時間不明 134 116 198 182 175 98 21 191 6 147 114 197 173 167 96 22 65 18 44 38 56 54 53 51 23 171 時間不明 112 96 182 163 176 105 24 85 5 43 39 78 52 55 50 25 186 8 136 99 199 178 163 102

3 討論

對乙酰氨基酚是一種臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，已經(jīng)逐漸取代了阿司匹林的解熱鎮(zhèn)痛作用。主要代謝部位為肝臟。自殺或誤服等大劑量服用時，有嚴重的肝損傷，甚至導致肝壞死。目前對乙酰氨基酚中毒致肝損傷的病理機制尚不明確。一般認為，對乙酰氨基酚所引起的原發(fā)性肝細胞毒性：在藥物的生物轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生較大的自由基代謝產(chǎn)物N-乙酰-對苯醌亞氨（NAPQI），進而導致肝損害的發(fā)生[5,6]；肝細胞線粒體功能障礙、氧化應激和細胞因子等在對乙酰氨基酚肝損害的發(fā)生及發(fā)展過程中也起重要作用。其中細胞因子在對乙酰氨基酚肝損害中的作用取決于親炎細胞因子（pro-inflammatory cytokine）和抗炎細胞因子（anti-inflammatory cytokine）之間的平衡。趨化性細胞因子(chemokine)又稱趨化因子或趨化蛋白，專指一組小分子量8～10KD的細胞因子，它們參與白細胞特別是吞噬細胞和淋巴細胞的游走與活化，在炎癥反應中起中心作用；其中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1 ,MCP-1）是主要作用于單核細胞與巨噬細胞的趨化因子，可由多種細胞分泌，包括成骨細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、纖維母細胞、單核細胞、表皮細胞和某些腫瘤細胞[7-12]。趨化性細胞因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR2）是MCP-1的生理性受體，二者結(jié)合后不僅具有吸附單核細胞移動的功能，而且對血管內(nèi)皮細胞粘附分子的表達亦具有調(diào)節(jié)作用。Dambach DM 等發(fā)現(xiàn) MCP-1、CCR2在對乙酰氨基酚中毒小鼠的肝臟組織中的表達明顯升高 ，Hogaboam CM等發(fā)現(xiàn)敲除CCR2基因后對乙酰氨基酚中毒小鼠的肝臟損傷明顯減輕[13-15]。本研究采用ELISA方法檢測血清中MCP-1、CCR2的動態(tài)表達發(fā)現(xiàn)：口服對乙酰氨基酚4小時后MCP-1、CCR2在血液中的表達明顯增加，12小時后均有所下降，但變化不明顯（P＞0.05），表明對乙酰氨基酚在體內(nèi)隨時間發(fā)生分布代謝出現(xiàn)血藥濃度降低，由于 MCP-1對單核/巨噬細胞的強烈趨化作用，趨化的單核/巨噬細胞再表達 MCP-1能夠再趨化和激活更多的單核/巨噬細胞至炎癥損傷部位；推測MCP-1、 CCR2可能參與了對乙酰氨基酚肝損害的病理過程。

[1]Prescott LF.Paracetamol(acetaminophen):A critical bibliographic review[J].London TaylorandFrancis,1996.

[2]Nourjal p,Ahrnad SR,Karwoski C,et al,Estimates of ucetaminophen(Paracetomal)-associated overdoses in the United States[J].Pharmacoepidemiol Drug Staf,2006,15(6);398-405.

[3]Lewis R,Goldfrank Goldfrank’s toxicologic emergencies [M]Ed5 Appleton& Lathe,1994:487

[4]汪倩,徐瑞娟,楊勁.對乙酰氨基酚肝毒性機理及藥物干預靶點[J].藥學研究與臨床,2011,6;19(3)

[5]Moyer AM, Fridley BL, Jenkins GD, Batzler AJ, Pelleymounter LL, Kalari KR, Ji Y, Chai Y, Nordgren KK,Weinshilboum RM.Acetaminophen-NAPQI hepatotoxicity: a cell line model system genome-wide association study[J].Toxicol Sci, 2011,5,120(1):33-41.

[6]Agarwal R, MacMillan-Crow LA, Rafferty TM, Saba H, Roberts DW, Fifer EK, James LP, Hinson JA.Acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice occurs with inhibition of activity and nitration of mitochondrial manganese superoxide dismutase[J].J Pharmacol Exp Ther, 2011,4,337(1):110-116.

[7]larrey D,Pageaux GP.Drug-induced acute liver failure[J].Eur Gastroenterrol Hepatol,2005,17(2):141-143.

[8]Russo MW,Galanko JA,Shrestha R,etal,liver transplantation for acute liver failure from drug induced liver injury in the United States[J].Liver Transpl,10(8):1018-1023.

[9]Smilkstein MJ,Knapp GL,Kuling kw et al[J].N Engl J Med,1989,319:1557-1580.

[10]Rollins BJ.Chemokines[J].Blood,1997,90:909-928.

[11]Mukaida N,harada,A,Matsushima K et al.Interleukin-8(IL-8) and monocyte Chemotactic and activating factors (MCAF/MCP-1), Chemokines essentially involved in inflammtory and immune reactions[J].Cytokine Growth Factor Rev,1998,9:9-23.

[12]Gerard C,Rollins BJ.Chemokines and disease[J].Nat Immunol,2001,2:108-115.

[13]James LP, McCullough SS, Lamps LW, Effect of N-acetylcysteine on acetaminophen toxicity in mice: relationship to reactive nitrogen and cytokine formation[J].Toxicol Sci,2003,10,75(2):458-67.

[14]Dambach DM, Watson LM, Gray KR, Role of CCR2 in macrophage migration into the liver during acetaminophen-induced hepatotoxicity in the mouse[J].Hepatology,2002,5,35(5):1093-103.

[15]Hogaboam CM, Bone-Larson CL, Steinhauser ML, Exaggerated hepatic injury due to acetaminophen challenge in mice lacking C-C chemokine receptor 2[J].Am J Pathol,2000,4,156(4):1245-52.

北京大學深圳醫(yī)院急診科，廣東深圳 518036