張永旺李靈芝* 龔海英呂 琪董 培

葛根素對MCF-7細胞的雌激素樣促增殖作用※

張永旺1李靈芝2* 龔海英2呂 琪2董 培2

目的以乳腺癌細胞株MCF-7為靶細胞，考察葛根素對其細胞形態(tài)及增殖的影響。方法以人乳腺癌細胞株MCF-7為靶細胞，以雌酚酮1×10-8mol/L為陽性對照，同時設(shè)空白對照組，葛根素干預組分為1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L三個濃度組。①調(diào)整細胞濃度為4×104個/L，接種于12孔培養(yǎng)板上。48h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。②調(diào)整細胞濃度為2×104個/L，接種于96孔培養(yǎng)板，采用四唑鹽法測定各孔的吸光度，計算平均增殖率。上述實驗每組均設(shè)8個復孔。③調(diào)整活細胞濃度為0.9×104個/ml，接種于24孔培養(yǎng)板。24h后，每組設(shè)12個復孔。每天隨機從每組細胞中各選出3個孔，染色后在光鏡下計數(shù)活細胞數(shù)，取平均值。連續(xù)計數(shù)3天，以時間為橫坐標，活細胞數(shù)為縱坐標，作圖得細胞生長曲線。結(jié)果經(jīng)葛根素1×10-7mol/L、1×10-6mol/L處理后第1天、第2天和第3天，與空白對照組相比，增殖速度均加快。結(jié)論葛根素可劑量依賴地促進MCF-7細胞的增殖，提示其具有弱雌激素樣作用。

葛根素/藥理學；乳腺癌細胞/藥物作用；細胞培養(yǎng)；細胞增殖/藥物作用

葛根素是中藥葛根的主要有效成分，其結(jié)構(gòu)與植物性雌激素大豆異黃酮極其相似。推測其可能與大豆異黃酮一樣具有弱雌激素活性。本實驗以雌激素依賴性乳腺癌細胞株MCF-7為靶細胞，考察了不同濃度的葛根素對乳腺癌MCF-7增殖影響，以研究葛根素的雌激素活性。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 細胞株、藥品及試劑乳腺癌MCF-7細胞由武警醫(yī)學院細胞生物教研室提供，購自北京大學細胞培養(yǎng)實驗室。葛根素（Puerarin）購自中國藥品生物制品檢定所，雌酚酮購自浙江仙居制藥廠。α-MEM（Minimum Essential Medium Alpha Modification）培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎盼藍、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基-四唑氫溴酸鹽（MTT）、胰蛋白酶（Trypsin）、Hepes為美國Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所；氨芐青霉素（Ampicilin sodium salt）、鏈霉素（Streptomysin）均為美國Amresco公司產(chǎn)品；二乙醇胺（DEA）購自北京中聯(lián)化工試劑廠；對硝基苯酚磷酸鈉（PNPP）為Sigma分裝。

1.1.2主要試劑及設(shè)備SW-LZ-ZFO型超凈工作臺（中國蘇州）；Forma3111型CO2培養(yǎng)箱（美國）；CK-40型OLYMPUS倒置光相差顯微鏡（日本）；Bio-Rad550型酶標儀（美國伯樂公司）。

1.2方法

1.2.1實驗分組乳腺癌MCF-7細胞體外培養(yǎng)于完全α-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)含 15%胎牛血清、2.2g/LNaHCO3、25mmol/Lhepes、100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞形態(tài)學觀察取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的乳腺癌MCF-7細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加完全α-MEM培養(yǎng)基吹打混勻，制成細胞懸液，染色，計數(shù)，調(diào)整活細胞濃度為 4×104個/ml，接種于12孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)板內(nèi)事先放置1.5×1.5cm2大小滅菌玻片。待24小時細胞完全貼壁后設(shè)空白對照組、雌酚酮1×10-8mol/L陽性對照組和葛根素干預組1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L組，每組設(shè)三個復孔。48小時后，在倒置顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)變化，并攝像記錄。以乳腺癌細胞株MCF-7為靶細胞，采用對照觀察的方法，以雌酚酮為陽性對照，同時設(shè)空白對照組（不加藥，只加等量細胞懸液和培養(yǎng)基）。

MCF-7細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察：將乳腺癌MCF-7細胞體外培養(yǎng)于完全α-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)含 150ml/L胎牛血清、2.2g/LNaHCO3、25mmol/Lhepes、100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素。置37℃、50ml/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，加完全α-MEM培養(yǎng)基吹打混勻，制成細胞懸液，染色，計數(shù)、調(diào)整活細胞濃度為 4×104個/ml，接種于12孔培養(yǎng)板。待24h細胞完全貼壁后，雌二醇陽性對照、正常對照組、空白對照組、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L葛根素干預組各設(shè)8個復孔，每孔加入細胞懸液2.7ml，相應(yīng)藥液0.3ml。48h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

葛根素對乳腺癌MCF-7細胞生長曲線的影響：取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的乳腺癌MCF-7細胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，調(diào)整活細胞濃度為0.9×104個/ml，接種于24孔培養(yǎng)板。待24h細胞完全貼壁后同上分組，每組設(shè)12個復孔，此時為加藥0d。以后每天隨機從五組細胞中各選出3個孔，用4.0g/L胎盼藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)，取平均值。連續(xù)計數(shù)3d，以時間為橫坐標，活細胞數(shù)為縱坐標，作圖得細胞生長曲線。

葛根素對MCF-7細胞增殖的影響：調(diào)整細胞濃度為2×104個/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液180uL，待24h后，加入上述3個濃度的葛根素，每孔20uL，另設(shè)空白對照組。每組設(shè)8個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，采用四唑鹽法以490nm為測量波長，655nm為參比波長測定各孔的吸光度（A值）。計算平均增殖率。

1.3主要觀察指標觀察葛根素對 MCF-7細胞增殖的影響。

1.4統(tǒng)計學分析由作者采用 SPSS統(tǒng)計軟件完成。數(shù)據(jù)用（±s）表示，進行組間t檢驗，P＜0.05即認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

培養(yǎng)基中加入葛根素培養(yǎng) 2天后，葛根素 1×10-7mol/L、1×10-6mol/L 組和雌酚酮 1×10-8mol/L組可見細胞增殖明顯，與空白對照組相比細胞數(shù)量明顯增多。由細胞計數(shù)繪制的生長曲線，可見乳腺癌 MCF-7細胞經(jīng)葛根素 1×10-7mol/L、1×10-6mol/L和雌酚酮1×10-8mol/L處理后第 1、2、3天，與空白對照組相比，增殖速度均加快（圖1）。

圖1 葛根素對MCF-7細胞生長曲線的影響

細胞經(jīng)1×10-8mol/L雌酚酮處理第1、2、3天，細胞均較空白對照組增殖明顯。葛根素 1×10-7mol/L、1×10-6mol/L兩個劑量組也與空白對照組有極其顯著性差異（表1）。

表1 葛根素對培養(yǎng)不同時段乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響（±s，n=8）

表1 葛根素對培養(yǎng)不同時段乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響（±s，n=8）

注：*與對照組相比，P＜0.01。括號外為MTT法測得的A值，括號內(nèi)為增殖率

A值（增殖率）組別 劑量（mol/L）第1天 第2天 第3天對照組 --0.524±0.014 1.198±0.013 2.689±0.055雌酚酮組 1×10-80.713±0.011*（36.1%）2.262±0.021*（88.8%）4.692±0.055*（74.4%）1×10-80.562±0.027（7.2%）1.265±0.031（5.5%）2.895±0.073（7.6%）1×10-70.674±0.023*（28.6%）1.784±0.035*（48.9%）3.209±0.064（19.3%）葛根素組1×10-60.722±0.024*（37.8%）1.889±0.022*（57.6%）3.598±0.052*（33.8%）

3 討論

葛根總黃酮主要包括葛根素、大豆甙及甙元、金雀異黃素等。大豆甙元被稱為植物雌激素，對于絕經(jīng)后更年期綜合癥及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥均具有有益作用。葛根素具有與大豆甙元相同的異黃酮母環(huán)結(jié)構(gòu)，我們研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以劑量依賴地促進體外培養(yǎng)小鼠胚胎長骨的生長[1]，并促進長骨ERα[2]和 ERβ[3]的表達；文獻報道葛根素對于幼雌小鼠子宮也表現(xiàn)出雌激素樣刺激增殖作用[4]，但我們采用成年小鼠進行試驗時，未發(fā)現(xiàn)其對子宮的刺激增殖作用[5]。故關(guān)于葛根素的雌激素活性尚需進行進一步研究證實。

雌激素依賴性乳腺癌 MCF-7細胞株源于人乳腺癌細胞，具有明顯的雌激素依賴特征，且易培養(yǎng)，常用于研究藥物的雌激素活性，其增殖程度可反映藥物的雌激素活性強度。本實驗結(jié)果顯示，葛根素可明顯促進的MCF-7細胞增殖，并在1×10-8mol/L、1×10-6mol/L范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng)，但其活性明顯低于同劑量的雌酚酮，提示葛根素具有弱的雌激素樣活性。大豆甙元具有與天然雌激素相似的空間結(jié)構(gòu)，故具有弱雌激素樣作用及與雌激素受體結(jié)合的特性[6]，葛根素與大豆甙元結(jié)構(gòu)極為相似，僅在8-位相差一糖基，提示葛根素的弱雌激素樣活性可能也是源于其與天然雌激素相似的空間結(jié)構(gòu)，因而與雌激素受體具有弱的親和力。

[1]鄭忠志,李靈芝,劉啟兵,等.葛根素體外影響骨生長的形態(tài)學研究[J].武警醫(yī)學院學報,2005,14(2):111-113.

[2]李靈芝,劉啟兵,張永亮,等.葛根素對小鼠長骨 ERα表達的影響[J].中國新藥雜志,2006,15(20):1473-1476.

[3]李靈芝,張永亮,劉啟兵,等.葛根素體外影響小鼠胚胎長骨雌激素受體β表達的作用[J].中國臨床康復雜志,2006,10(35):25-27.

[4]鄭高利,張信岳,鄭經(jīng)偉,等.葛根素和葛根總黃酮的雌激素樣活性[J].中藥材,2002,25(8):566-568.

[5]鄭忠志,胡斌,畢玉彪,等.葛根素對成年小鼠子宮的影響[J].武警醫(yī)學,2005,16(3):117-119.

[6]Schmitt, Dekant W, Stopper H.Assaying the estrogenicity of phytoestrogens in cells different ertrogen sensitive tissues[J].Toxicol In Vitro, 2001,15(4-5):433-439.

中醫(yī)藥慢性病防控暨中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合防治慢性心、肺、腎疾病學術(shù)會議通知

為發(fā)揮中醫(yī)藥在防治慢性心、肺、腎疾病方面的特色優(yōu)勢，促進學術(shù)發(fā)展，由中華中醫(yī)藥學會主辦，《世界中西醫(yī)結(jié)合》雜志社、河南省中醫(yī)藥學會、河南省現(xiàn)代醫(yī)學研究院中醫(yī)院承辦的“中醫(yī)藥慢性病防控暨中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合防治慢性心、肺、腎疾病學術(shù)會議”擬于2012年8月18～19日在河南鄭州召開。

為方便參會代表相互學習交流，組委會將編輯優(yōu)秀論文集（面向全國征集中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合防治慢性心、肺、腎疾病及糖尿病的理論、臨床及藥物應(yīng)用研究；中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤的理論、臨床、實驗、經(jīng)驗總結(jié)及藥物應(yīng)用研究；中醫(yī)治未病、養(yǎng)生保健經(jīng)驗研究；名老中醫(yī)經(jīng)驗總結(jié)；中醫(yī)特色療法及絕技良方等相關(guān)論文，投稿信箱：zgywjjx@126.com）。屆時邀請部局領(lǐng)導、專家、學者及業(yè)界同仁參加會議；詳情登陸雜志社網(wǎng)站www.zhongxi.org或www.hnzy.cc查詢，會議具體時間為2012年8月18～19日，17日全天報到（河南省鄭州市嵩山飯店）；會議咨詢電話：010-6482 2252鮑老師（北京），0371-6 0999219，13837195682郭老師（鄭州）。

中華中醫(yī)藥學會學術(shù)部 《世界中西醫(yī)結(jié)合》雜志社

二零一二年二月二十一日

1 張永旺（1974-），籍貫內(nèi)蒙烏蘭察布市，主治醫(yī)師，主要從事臨床工作。內(nèi)蒙古烏蘭察布市卓資縣人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012300

2 武警后勤學院，天津 300162

※基金來源：國家自然科學基金（1073152），天津市重點項目（10JCZDJC21100）

*通訊作者：李靈芝，博士，教授。