[摘 要] 目的：研究食品中霉菌的檢測(cè)方法。方法：釆用不同的培養(yǎng)基、不同的接種方法對(duì)食品中的霉菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：孟加拉紅培養(yǎng)基和傾注法更適合進(jìn)行食品中霉菌的計(jì)數(shù)。

[關(guān)鍵詞] 霉菌；孟加拉紅培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基；傾注法；涂布法

[作者簡(jiǎn)介] 施震地，啟東市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所工程師，江蘇 啟東，226200

[中圖分類號(hào)] D155.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1007-7723（2012）12-0006-0003

霉菌廣泛分布于自然界中，同時(shí)由于其可形成各種微小的孢子，因而很容易污染食品。霉菌污染食品后不僅可造成腐敗變質(zhì)，而且有些霉菌還可產(chǎn)生毒素，人畜因誤食霉菌毒素而中毒。霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的一種有毒的次生代謝產(chǎn)物，自從20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致癌的黃曲霉毒素以來，霉菌與霉菌毒素對(duì)食品的污染日益引起重視。我國在2011年頒布了國家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》，各級(jí)食品監(jiān)督檢測(cè)機(jī)構(gòu)全面開展霉菌的檢測(cè)工作。本文主要對(duì)日常食品中霉菌的檢驗(yàn)方法及檢驗(yàn)過程中遇到的幾個(gè)問題進(jìn)行探討。

一、檢驗(yàn)方法的選擇

國內(nèi)現(xiàn)行有效的食品中霉菌的檢測(cè)方法有兩種：一種是GB4789.15-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)[1]；另外一種是食品中霉菌和酵母計(jì)數(shù) PetrifilmTM測(cè)試片法[2]。這兩種方法主要區(qū)別如下：

1. 樣品稀釋液的不同。測(cè)試片要求1%的蛋白胨水或者磷酸鹽緩沖液，而國標(biāo)方法使用滅菌的蒸餾水即可。

2. 相對(duì)于國標(biāo)法，測(cè)試片法操作起來簡(jiǎn)潔方便，不用對(duì)大量的培養(yǎng)皿進(jìn)行滅菌，不用制備培養(yǎng)基，樣品稀釋后直接接種，省時(shí)快速。

3. 測(cè)試片法所用的測(cè)試片價(jià)格比較昂貴。

綜上所述，一般情況下我們還是選擇國標(biāo)法。

二、培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料和檢驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。目前國標(biāo)方法中使用的培養(yǎng)基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、孟加拉紅培養(yǎng)基（RBC）。我們用這兩種培養(yǎng)基對(duì)相同樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，有以下發(fā)現(xiàn)：

1. 在培養(yǎng)基配制過程中， PDA培養(yǎng)基能完全溶解，但澄清度不夠；而RBC能完全溶解，溶解后清亮透明（見圖1）。RBC傾注后在較短的時(shí)間就會(huì)凝固，而PDA則需要更長(zhǎng)的時(shí)間。

2. 霉菌在PDA培養(yǎng)基與RBC培養(yǎng)基都生長(zhǎng)良好，但由于PDA培養(yǎng)基有無法完全溶解的細(xì)小白色粒子，與白色的霉菌菌落在一起，常常會(huì)干擾我們對(duì)霉菌的計(jì)數(shù)；而RBC上生長(zhǎng)的都是紅色菌落，而且無細(xì)小粒子的干擾，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)（見圖2）。

三、接種方式

常用的微生物接種方式主要有傾注法和平板涂布法。國標(biāo)方法中采用傾注法，然而有實(shí)驗(yàn)和報(bào)道證實(shí)[3]，霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法更合適。日常檢驗(yàn)中我們對(duì)傾注法和平板涂布法進(jìn)行比較：

1. 在操作上：傾注法要求將培養(yǎng)基溶化之后冷卻至45℃左右，手感不燙，再注入培養(yǎng)皿中，但在實(shí)際操作中，很難精準(zhǔn)地控制培養(yǎng)基溫度。培養(yǎng)基溫度過高可能會(huì)使霉菌孢子受熱損傷甚至死亡，而等待培養(yǎng)基冷卻，會(huì)使霉菌稀釋液保持時(shí)間過長(zhǎng)。如果培養(yǎng)基過度冷卻，便無法傾倒注入培養(yǎng)基中。所以在平時(shí)的檢驗(yàn)過程中，一是注意樣品稀釋與培養(yǎng)基冷卻應(yīng)同步進(jìn)行；二是利用恒溫水浴讓培養(yǎng)基保持溫度，從而可以避免以上情況的發(fā)生。

2. 涂布法培養(yǎng)所需的時(shí)間較短，培養(yǎng)出的霉菌菌落數(shù)較多，霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。這是因?yàn)榻^大多數(shù)霉菌屬于好氧型，在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)快，發(fā)育好，而混在培養(yǎng)基中發(fā)育會(huì)受到影響。

3. 涂布法是先制備培養(yǎng)基，后接種，因而可以檢查培養(yǎng)基是否染上雜菌。

4. 由于涂布法吸收量較少，操作比較麻煩，如果平板干燥效果不好，容易使霉菌生長(zhǎng)蔓延。涂布過程必須均勻，否則不利于單個(gè)菌落生長(zhǎng)。傾注法要求每個(gè)稀釋度吸取1mL，便于菌落的計(jì)數(shù)；采用涂布法，培養(yǎng)基通常表面涂0.1mL的量，對(duì)于霉菌菌落的計(jì)數(shù)就不夠準(zhǔn)確；而如果涂布1mL的量，等待干燥的時(shí)間過長(zhǎng)，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)無法完全干燥的現(xiàn)象，霉菌得不到更好的培養(yǎng)，也就無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

5. 在日常檢測(cè)中，通常采用涂布棒進(jìn)行樣液的涂布，由于涂布棒會(huì)附著少量的樣液影響接種量。所以，我們?cè)趯?shí)踐中吸取一定量的樣液后，旋轉(zhuǎn)平板，讓樣液盡量均勻地布滿整個(gè)培養(yǎng)基，也能達(dá)到涂布的效果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基上樣液不容易流動(dòng)分布，而RBC上的樣液經(jīng)轉(zhuǎn)動(dòng)平板，樣液較易均勻分布（見圖3）。

四、培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度按照國標(biāo)規(guī)定，一般情況下都采用28℃±1℃培養(yǎng)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)溫度低于25℃或高于30℃時(shí)會(huì)直接影響霉菌的生長(zhǎng)。

五、培養(yǎng)時(shí)間

正常培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)3～4天的菌落數(shù)與5～6天的基本相同，但菌種的特征不明顯。因此，如果只要作霉菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)3～4天已基本達(dá)到目的，但對(duì)于無菌落的，則需要培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間。曾經(jīng)在檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)幾種霉菌生長(zhǎng)特別快、菌絲很多，在培養(yǎng)后第二天就可計(jì)數(shù) ，如再延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間菌絲就會(huì)覆蓋整個(gè)平皿，無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。這類霉菌污染比較普遍，檢測(cè)這類樣品，應(yīng)提早觀察記錄。如圖4，同樣的樣品在兩個(gè)RBC培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布接種，一個(gè)培養(yǎng)了2天，一個(gè)培養(yǎng)了5天。

六、菌落計(jì)數(shù)

霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當(dāng)擴(kuò)散。在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交叉重疊，影響計(jì)數(shù)，但數(shù)量太少又會(huì)產(chǎn)生較大的誤差。因此，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪扔?jì)數(shù)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。通常選擇產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)最上限規(guī)定來選擇三個(gè)稀釋度，再按照國標(biāo)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行結(jié)果報(bào)告。對(duì)污染較重的樣品需要增加一個(gè)稀釋度，以便結(jié)果更為準(zhǔn)確。

七、結(jié) 語

1. 如果被檢驗(yàn)食品的數(shù)量很大時(shí)，建議采用測(cè)試片法，可以縮短檢驗(yàn)時(shí)間，縮短整個(gè)檢驗(yàn)周期。

2. 涂布法與傾注法的選擇，在樣品量較多時(shí)，選擇傾注法可以提高效率，前提是要控制好培養(yǎng)基的溫度；而涂布法更適宜霉菌的鑒定，而且在涂布時(shí)必須要涂布均勻。

3. 由于霉菌檢測(cè)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，中間必須進(jìn)行多次觀察，因此在實(shí)驗(yàn)前要做好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，確定觀察記錄的時(shí)間。通常在培養(yǎng)24h后就應(yīng)該進(jìn)行觀察，對(duì)生長(zhǎng)迅速的，菌絲很長(zhǎng)的一類霉菌48h后就可計(jì)數(shù)。

4. 霉菌孢子易在空氣中傳播，所以檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)必須在霉菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，整個(gè)檢驗(yàn)過程保持平靜，減少空氣流通；操作時(shí)動(dòng)作要快、輕，特別是培養(yǎng)過程中，如果觀察時(shí)動(dòng)作過大，早期生長(zhǎng)出的霉菌孢子就會(huì)在培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成新的菌落，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

5. 從霉菌接種開始時(shí)，應(yīng)在操作臺(tái)旁打開兩塊滅菌平皿，待接種結(jié)束后，澆注培養(yǎng)基，和檢樣同時(shí)進(jìn)行霉菌培養(yǎng)，對(duì)整個(gè)接種過程進(jìn)行驗(yàn)證，可發(fā)現(xiàn)在整個(gè)接種過程中是否受環(huán)境污染。

6. 檢驗(yàn)前應(yīng)認(rèn)真做好全面的消毒滅菌工作，檢驗(yàn)后應(yīng)第一時(shí)間將有霉菌的培養(yǎng)物高壓滅菌，以防進(jìn)一步污染。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)[S].

[2]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2566-2010食品中霉菌和酵母計(jì)數(shù) PetrifilmTM測(cè)試片法[S].

[3]Matsuda，H. Comparative study of the spread plate and pour plate techniques in terms of colony forming units of fungi [J].Journal of Antibacterial Antifung Agent. 1995（23） 613-618.