劉洋洋 童彥杰 宋楊 等

摘要：設(shè)置單因素試驗考察不同濃度離子液體氯化１－丁基－３－甲基咪唑（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）對釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＳ２．３９９生長及其乙醛脫氫酶活性的影響。結(jié)果表明，［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母的生長有抑制作用，且其濃度越高，抑制作用越明顯；低濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ可以提高酵母乙醛脫氫酶的活性，高濃度則會抑制其活性。

關(guān)鍵詞：氯化１－丁基－３－甲基咪唑（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）；酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＳ２．３９９；生長；乙醛脫氫酶活性

中圖分類號：ＴＱ２０９；Ｑ１４２．３文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3306-02

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｏｎｉｃ Ｌｉｑｕｉｄ １－Ｂｕｔｙｌ－３－Ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｎｅ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ａｌｄｅｈｙｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ

ＬＩＵ Ｙａｎｇ－ｙａｎｇ１，ＴＯＮＧ Ｙａｎ－ｊｉｅ２，ＳＯＮＧ Ｙａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｒｕｉ２，ＺＨＵ Ｓｈｅｎｇ－ｄｏｎｇ２，ＷＵ Ｙｕａｎ－ｘｉｎ１，２

（１．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７0， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄ １－ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｎｅ（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ） ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｌｄｅｈｙｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ） ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＳ２．３９９ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｇｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ［ＢＭＩＭ］Ｃｌ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｙｅａｓｔ． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈｅ［ＢＭＩＭ］Ｃｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＬＤＨ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｂｙ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ［ＢＭＩＭ］Ｃｌ ｗｈｉｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： １－ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｎｅ（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＳ２．３９９； ｇｒｏｗｔｈ； ＡＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ

離子液體（Ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ，ＩＬｓ）是指在室溫或者接近于室溫下呈液態(tài)的由離子構(gòu)成的有機鹽［１］。離子液體作為一種新型有機溶劑，具有無可測蒸汽壓、可循環(huán)使用、對空氣無污染等優(yōu)點［２，３］，已被成功地應(yīng)用到化學(xué)合成、化學(xué)分離以及電化學(xué)等方面［４］。隨著離子液體在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，其自身的綠色性也越來越受到關(guān)注，如其在自然界和生物體內(nèi)如何降解，累積度對生物體的毒性如何等［５］。乙醛脫氫酶又稱醛脫氫酶，是一類依賴ＮＡＤ（Ｐ）的氧化還原酶，可催化乙醛或其他醛類轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的酸類［６，７］，能緩解飲酒后大量乙醇代謝成乙醛對人體造成的毒害［８］，是近年來研究的熱點［９，１０］。本研究以實際生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的離子液體氯化１－丁基－３－甲基咪唑鹽（［ＢＭＩＭ］Ｃｌ）為研究對象，考察其對釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＳ２．３９９生長及其乙醛脫氫酶活性的影響，為離子液體的推廣應(yīng)用及安全性鑒定提供一定的理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料與儀器

釀酒酵母ＡＳ２．３９９為武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院４１２實驗室保藏菌株。實驗用離子液體［ＢＭＩＭ］Ｃｌ購自河南利華制藥公司；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；生物培養(yǎng)基購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。Ｏｎｅ ｓｈｏｔ高壓細(xì)胞破碎儀（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＵＶ－２１０２ＰＣ型紫外分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ ３２Ｒ臺式冷凍離心機（德國Ｈｅｔｔｉｃｈ公司）。

１．２方法

１．２．１［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母菌體生長的影響分別配制［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度為０．００１、０．１００、２．０００、５．０００、２５．０００、５０．０００和１００．０００ ｍｇ／ｍＬ的ＹＰＤ液態(tài)培養(yǎng)基，接種后培養(yǎng)基ＯＤ６００ ｎｍ＝０．１２５，培養(yǎng)至菌體生長到一定濃度時取樣（接種后每隔２～３ ｈ取樣，具體根據(jù)菌體生長情況決定，下同）并測定其在６００ ｎｍ處的吸光度。

１．２．２［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母乙醛脫氫酶活性的影響將酵母接種到添加了不同濃度［ＢＭＩＭ］Ｃｌ的ＹＰＤ培養(yǎng)基中，每隔２～３ ｈ取樣測ＯＤ６００ ｎｍ，并稀釋到ＯＤ６００ ｎｍ＝１．０００，用高壓細(xì)胞破碎儀將其破碎，４ ℃下12 ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取３００ μＬ上清液加入酶活反應(yīng)體系（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 ０．１0 ｍＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ０．３0 ｍＬ（ｐＨ ８．０）、１ ｍｏｌ／Ｌ巰基乙醇 ０．０５ ｍＬ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ乙醛０．１0 ｍＬ、３ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ ０．１0 ｍＬ；雙蒸水２．０５ ｍＬ），立即測試其在３４０ ｎｍ處的吸光度。

１．２．３對數(shù)生長期添加［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母生長的影響將酵母菌體接種到ＹＰＤ培養(yǎng)基中，初始ＯＤ６００ ｎｍ＝０．１２５，３０ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)１８ ｈ后分裝到不同的無菌培養(yǎng)瓶中，添加５０ μＬ含不同濃度［ＢＭＩＭ］Ｃｌ的YPD培養(yǎng)基。每隔２～３ ｈ取樣并測其ＯＤ６００ ｎｍ。

２結(jié)果與分析

２．１不同濃度［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母菌體生長的影響

如圖１所示，酵母ＡＳ２．３９９的生長曲線隨著［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度的不同而變化，［ＢＭＩＭ］Ｃｌ會使菌體提前進入穩(wěn)定期，從而降低培養(yǎng)基中的菌體濃度。［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度越高，其對菌體生長的影響越大，菌體越早進入穩(wěn)定期。當(dāng)［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度達(dá)到１００.000 ｍｇ／ｍＬ時，菌體的生長被嚴(yán)重抑制，在培養(yǎng)基中濃度的增幅很小。［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度為０．００１、０．１００、２．０００、５．０００、２５．０００、５０．０００和１００．０００ ｍｇ／ｍＬ時，培養(yǎng)40 h 后培養(yǎng)基中菌體的濃度分別為對照組的９２％、７５％、６４％、５７％、３８％、３１％、８％。

２．２［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母乙醛脫氫酶活性的影響

為保證酵母菌體的濃度相同，以反映單個細(xì)胞內(nèi)乙醛脫氫酶活性的差異，將測試酶活的樣品稀釋到相同的濃度（ＯＤ６００ ｎｍ＝１．０００）。如圖２所示，不同濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對菌體乙醛脫氫酶活性的影響不同。低濃度（０．００１、０．１００ ｍｇ／ｍＬ）的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ下菌體的乙醛脫氫酶活性比對照有所升高，但當(dāng)［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度大于２．０００ ｍｇ／ｍＬ時，菌體的乙醛脫氫酶活性受到抑制，并且隨著其濃度的升高，抑制作用越明顯。

２．３對數(shù)生長期添加［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母菌體生長的影響

當(dāng)酵母菌體生長到對數(shù)期時，添加不同濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ以考察其對菌體生長的影響。由圖３可知，［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對菌體的生長有明顯的影響，其不同的濃度對菌體有不同程度的生物毒性。［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度小于１．０００ ｍｇ／ｍＬ時，其對菌體的生長有抑制作用，但此時菌體尚未出現(xiàn)生長停滯狀態(tài)；而［ＢＭＩＭ］Ｃｌ濃度為５０．０００ ｍｇ／ｍＬ時，其嚴(yán)重抑制了菌體的生長，菌體的生長基本處于停滯狀態(tài)。

３結(jié)論

培養(yǎng)基中添加不同濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對釀酒酵母ＡＳ２．３９９的生長有抑制作用，觀察發(fā)現(xiàn)高濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ處理比對照組中存在更多的死酵母。因此，在［ＢＭＩＭ］Ｃｌ大規(guī)模使用的工業(yè)化生產(chǎn)中，必須先對廢液進行處理后才能排放，否則會對周邊環(huán)境中的微生物造成毒害作用，從而破壞生態(tài)平衡。低濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ對酵母乙醛脫氫酶的活性有促進作用，可能是因為菌體在［ＢＭＩＭ］Ｃｌ脅迫下的一種自我保護措施。然而高濃度的［ＢＭＩＭ］Ｃｌ具有生物毒性，會對菌體產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞作用。

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