葛劍 楊翠軍 孫茂紅 等

摘要：為了觀察馬齒莧多糖（Ｐｏｒｔｕｌａｃｅ oｌｅｒａｃｅａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＰＯＰ）對(duì)雛雞胸腺免疫功能的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，試驗(yàn)通過對(duì)雛雞灌注不同劑量的ＰＯＰ，測(cè)定雛雞胸腺指數(shù)，應(yīng)用ＭＭＴ（四甲基偶氮唑鹽比色法）方法測(cè)定雛雞胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，利用流式細(xì)胞器測(cè)定雛雞胸腺淋巴細(xì)胞周期與胸腺Ｔ淋巴細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果表明，ＰＯＰ能顯著增加雛雞胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和胸腺指數(shù)（Ｐ＜０．０５），淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著提高（Ｐ＜０．０５），ＣＤ４＋ Ｔ淋巴細(xì)胞含量顯著增加（Ｐ＜０．０５），ＣＤ８＋ Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量變化不明顯，ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ淋巴細(xì)胞比值顯著升高（Ｐ＜０．０５）。ＰＯＰ可通過調(diào)節(jié)雛雞胸腺內(nèi)細(xì)胞水平的變化，增強(qiáng)雛雞細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞：雛雞；馬齒莧多糖（ＰＯＰ）；胸腺指數(shù)；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)；ＣＤ４＋／ＣＤ８＋

中圖分類號(hào)：Ｒ２８５；Ｓ８５２．４文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3264-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｏｒｔｕｌａｃｅ oｌｅｒａｃｅａ Pｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｎ Ｔｈｙｍｕｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ

ＧＥ Ｊｉａｎa，ＹＡＮＧ Ｃｕｉ－ｊｕｎb，ＳＵＮ Ｍａｏ－ｈｏｎｇa，ＬＩ Ｘｉｕ－ｈｕａa

（a． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；b． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈａｎｇｊｉａｋｏｕ ０７５０００， Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＯＰ（Ｐｏｒｔｕｌａｃｅ oｌｅｒａｃｅａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ） ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｙｍｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ， ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ４０ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｌｌｏｃａｔｅｄ ｔｏ ４ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ＰＯＰ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌ. Aｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘｅｓ， ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｔｈｙｍｕｓ ｃｅｌｌ ｐｅｒｉｏｄ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ（ＭＴＴ） ａｎｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘｅｓ， ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ， ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃｅｓ（ＬＰＩ）， ａｎｄ ｔｈｅ ＣＤ４＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｏｆ ＰＯＰ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ＜０．０５）. Tｈｅｒｅ was ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ＣＤ８＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ； ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ was ｉｎｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜０．０５）． Ｉｔ was ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＰＯＰ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ changes ｉｎ ｔｈｙｍｕｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｈｉｃｋｅｎ； ＰＯＰ； ｔｈｙｍｕｓ ｉｎｄｅｘｅｓ； ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ； ＬＰＩ； ＣＤ4＋／ＣＤ８＋

中藥多糖廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物細(xì)胞和細(xì)胞壁中，具有促進(jìn)機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗炎、降低血脂以及改善動(dòng)物生產(chǎn)性能等一系列作用。其中多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是主要的，它對(duì)機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能具有增強(qiáng)作用，其作用機(jī)制是通過刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化、促進(jìn)抗體生成、誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌、激活補(bǔ)體系統(tǒng)等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)。尤其是中藥多糖作為一種幾乎無毒副作用的天然提取物，其藥理作用甚廣，在促生長及增強(qiáng)機(jī)體免疫方面有著重要的作用，是一類天然免疫增強(qiáng)劑［１－３］。

中藥馬齒莧（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）為藥食兩用馬齒莧科植物，是我國衛(wèi)生部劃定的７８種藥食同源的野生植物之一。含有多種化學(xué)成分，包括蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、氨基酸、多糖、生物堿、黃酮類等，具有抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫功能等藥理活性作用。其中馬齒莧多糖（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＰＯＰ）是馬齒莧的主要有效成分之一，已引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，馬齒莧多糖具有提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能、促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、提高正常家兔淋巴細(xì)胞和ＰＨＡ誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的增殖能力、扶植腸道正常菌群生長、調(diào)整菌群失調(diào)、防止感染等功能；并具有促進(jìn)大鼠受損結(jié)腸黏膜修復(fù)，緩解大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的效應(yīng)［４－８］。但迄今為止，關(guān)于馬齒莧多糖對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能的影響研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過對(duì)雛雞灌注不同劑量的ＰＯＰ，觀察雛雞胸腺指數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、胸腺內(nèi)細(xì)胞周期的變化，探討ＰＯＰ對(duì)雛雞免疫性能的影響，以期為馬齒莧在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用提供參考。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

馬齒莧多糖：馬齒莧原藥購自張家口市中醫(yī)院，馬齒莧多糖系自行制備（在實(shí)驗(yàn)中心制備）；試驗(yàn)動(dòng)物：１日齡雛雞由河北北方學(xué)院牧業(yè)研究所提供；主要儀器：ＦＡＣＳＡｒｉａ流式細(xì)胞儀（美國）；試劑：淋巴細(xì)胞分離液，ＰＥ（苯腎上腺素）熒光標(biāo)記小鼠抗雞ＣＤ４、ＣＤ８抗體，碘化丙啶，Ｃｏｎ Ａ。

１．２試驗(yàn)方法

試驗(yàn)選用１日齡雛雞４０只（體重差異不顯著）隨機(jī)分為４組：空白對(duì)照組Ⅰ和３個(gè)POP不同劑量試驗(yàn)組，分別為Ⅱ（POP劑量為２５ ｍｇ／ｋｇ）、Ⅲ（POP劑量為５０ ｍｇ／ｋｇ）、Ⅳ（POP劑量為１００ ｍｇ／ｋｇ），每組１０只，ＰＯＰ采用注射器口腔灌注，每天１次，試驗(yàn)期３周，至２１日齡結(jié)束；對(duì)照組灌注相同體積的生理鹽水；基礎(chǔ)日糧均統(tǒng)一飼喂商品育雛雞料，自由采食和飲水。

試驗(yàn)結(jié)束，各組分別稱重后頸部放血處死。無菌摘取雛雞胸腺，稱重并計(jì)算胸腺指數(shù)，胸腺指數(shù)＝胸腺濕重（ｍｇ）／體重（ｇ）。利用ＭＴＴ法（四甲基偶氮唑鹽比色法）測(cè)定由ＣｏｎＡ（刀豆素Ａ）誘導(dǎo)的胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以刺激指數(shù)（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｄｅｘ，ＳＩ）表示，ＳＩ＝ＣｏｎＡ刺激孔OＤ５７０ ｎｍ／對(duì)照孔OＤ５７０ ｎｍ。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胸腺淋巴細(xì)胞周期和Ｔ淋巴細(xì)胞亞群變化，ＭｏｄＦｉｔ軟件分析細(xì)胞周期和淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（ＰＩ），ＰＩ＝（Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）／（Ｇ１／Ｇ０＋Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）×１００％（Ｇ１期：ＤＮＡ合成前期；Ｓ期：ＤＮＡ合成期；Ｇ２期：ＤＮＡ合成后期；Ｍ期：細(xì)胞分裂期；Ｇ０期：暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂）。

１．３數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

流式細(xì)胞儀所測(cè)數(shù)據(jù)利用ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ軟件進(jìn)行分析；利用ＳＰＳＳ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和顯著性檢驗(yàn)，用ＬＳＤ法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

２結(jié)果與分析

２．１POP對(duì)雛雞胸腺指數(shù)和胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

由表１可見，不同劑量ＰＯＰ飼喂雛雞后，相對(duì)于對(duì)照組而言，ＰＯＰ各劑量組由Ｃｏｎ Ａ誘導(dǎo)的胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著提高（Ｐ＜０．０５），其中以ＩＶ組胸腺淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)；隨著POP劑量增加，ＰＯＰ各劑量組雛雞的胸腺指數(shù)顯著增高，且組間差異均顯著（Ｐ＜０．０５）。由此表明ＰＯＰ可顯著促進(jìn)雛雞胸腺淋巴細(xì)胞的增殖。

２．２POP對(duì)雛雞胸腺淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)變化的影響

雛雞經(jīng)不同劑量ＰＯＰ處理后，胸腺細(xì)胞周期發(fā)生變化。由表２可見，從對(duì)照組（Ⅰ）到試驗(yàn)組（Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），隨著ＰＯＰ劑量的增加，處于Ｇ１／Ｇ０期細(xì)胞所占比例顯著降低（Ｐ＜０．０５），Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期細(xì)胞所占比例顯著升高（Ｐ＜０．０５），其中Ｇ２／Ｍ期細(xì)胞在２５ ｍｇ／ｋｇ和５０ ｍｇ／ｋｇ劑量組間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），胸腺的ＰＩ值顯著上升（Ｐ＜０．０５）。胸腺內(nèi)細(xì)胞以Ｇ１／Ｇ０期為主，在８６％～９５％之間。

２．３POP對(duì)雛雞胸腺Ｔ淋巴細(xì)胞ＣＤ４＋、ＣＤ８＋亞群的影響

由表３可見，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組相比，胸腺ＣＤ４＋ Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著升高（Ｐ＜０．０５），隨著ＰＯＰ劑量的增加，試驗(yàn)Ⅲ組和Ⅳ組ＣＤ４＋ Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著高于Ⅱ組（Ｐ＜０．０５），但Ⅲ組和Ⅳ組間差異不顯著。雛雞經(jīng)不同劑量的ＰＯＰ處理后，胸腺ＣＤ８＋ Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)一定程度的增加，但各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均不顯著（Ｐ＞０．０５）。表明ＰＯＰ在對(duì)雛雞灌服３周內(nèi)，能顯著增加其胸腺ＣＤ４＋ Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量，提高其ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比值。

３小結(jié)與討論

中藥多糖毒性小，廣泛參與機(jī)體免疫代謝，人們對(duì)中藥多糖的研究日益增多。齊春會(huì)等［９］研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃多糖口服給藥對(duì)環(huán)磷酞胺處理小鼠脾細(xì)胞抗體生成反應(yīng)能力低下具有明顯的改善作用，體外應(yīng)用可直接促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)；Ｈａｎ等［１］研究發(fā)現(xiàn)，Ａｅａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｋｏｒｅａｎｕｍ（ＡＫ）多糖直接增強(qiáng)Ｂ細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生，能夠顯著增加ＩｇＭ的產(chǎn)生，促進(jìn)Ｂ細(xì)胞增殖；Ｂｅｎｄａ等［１０］在豬上試驗(yàn)了啤酒酵母多糖的佐劑活性，發(fā)現(xiàn)其可以顯著促進(jìn)小牛血清白蛋白和綿羊血清中人白蛋白抗體水平。

馬齒莧別名五行草、馬齒菜、長命菜等，為馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本野生植物，分布于全世界溫帶和熱帶地區(qū)。我國馬齒莧資源豐富，分布廣泛，其不僅具有藥用價(jià)值，還有很高的營養(yǎng)價(jià)值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧包含多糖類、黃酮類、生物堿類等多種化學(xué)成分，其中馬齒莧多糖具有抗氧化活性，并有提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能［１１，１２］。本試驗(yàn)應(yīng)用不同劑量的ＰＯＰ對(duì)雛雞進(jìn)行口腔灌注，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＰＯＰ能夠劑量依賴性提高雛雞胸腺指數(shù)及胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。而胸腺是禽類重要的中樞免疫器官之一，為Ｔ淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，胸腺的發(fā)育程度與雛雞免疫功能的發(fā)揮密切相關(guān)。證實(shí)ＰＯＰ能夠有效促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，且與ＰＯＰ具有劑量效應(yīng)關(guān)系，隨灌注劑量增大其效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)ＰＩ染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)ＤＮＡ含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為Ｇ１／Ｇ０期，Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期，并可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。Ｇ１期為細(xì)胞進(jìn)行大量物質(zhì)合成時(shí)期。Ｇ０期指細(xì)胞處于阻留的狀態(tài)，Ｇ０期是脫離細(xì)胞周期暫時(shí)停止分裂的一個(gè)階段，但在一定適宜刺激下又可進(jìn)入周期，合成ＤＮＡ與分裂。Ｓ期指在這一階段完成ＤＮＡ的合成以及合成與ＤＮＡ組裝構(gòu)成染色質(zhì)等有關(guān)的組蛋白，ＤＮＡ含量在此時(shí)期增加1倍。Ｇ２期是ＤＮＡ復(fù)制結(jié)束和開始有絲分裂之間的間隙，在這期間細(xì)胞合成某些蛋白質(zhì)和ＲＮＡ分子，為進(jìn)入有絲分裂提供物質(zhì)條件。Ｍ期為有絲分裂時(shí)期，是細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生快速變化的時(shí)期［１３］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的ＰＯＰ灌注雛雞后，胸腺細(xì)胞周期發(fā)生顯著改變，并且隨ＰＯＰ劑量的增大，雛雞脾臟內(nèi)Ｇ１／Ｇ０期細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，Ｓ期和Ｇ２／Ｍ期細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致胸腺細(xì)胞周期指數(shù)（ＰＩ）顯著增加，有效提高了雛雞免疫器官內(nèi)細(xì)胞的增殖。

ＣＤ４和ＣＤ８分子是Ｔ細(xì)胞表面Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是其表面標(biāo)志。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量與雞的免疫防御關(guān)系密切［１４，１５］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雛雞灌注不同劑量的ＰＯＰ后，ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量各試驗(yàn)組均較對(duì)照組顯著提高，對(duì)ＣＤ８＋Ｔ淋巴細(xì)胞數(shù)量影響不明顯，但顯著提高了ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ淋巴細(xì)胞比值。說明ＰＯＰ可通過增加ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞亞群數(shù)量，促進(jìn)胸腺的生長發(fā)育，增強(qiáng)雛雞的免疫力。

４結(jié)論

馬齒莧多糖能夠提高雛雞胸腺淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和胸腺指數(shù)，顯著提高淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)及ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞亞群含量，增強(qiáng)雛雞細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)其免疫器官的發(fā)育。

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